陸 明，姬飛虹，張林杰

牛蒡子在中國(guó)傳統(tǒng)中藥中具有抗炎利尿排毒的作用［1］，而其單一化合物提取物牛蒡子苷(arctiin，AC)或牛蒡子苷元(Arctigenin，ATG，圖1)亦具有免疫抑制功能和抑癌功能［2－3］，但ATG的免疫抑制機(jī)制尚不明確。mTOR作為一種保守的絲/蘇氨酸激酶，可以促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)的翻譯并促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，與細(xì)胞增殖、生存和代謝密切相關(guān)，并參與了免疫細(xì)胞激活和增殖［4－5］。該研究通過(guò)觀(guān)察ATG對(duì)小鼠原代脾細(xì)胞的作用，檢測(cè)mTOR通路的相關(guān)改變，探索ATG的免疫抑制機(jī)制。

1 材料與方法

圖1 Arctigenin結(jié)構(gòu)

1.1 材料 ATG購(gòu)于上海源葉生物;雷帕霉素(rapamycin，RAPA)購(gòu)于上海生工;BALB/c小鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;PRMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;青霉素、鏈霉素、吐溫20、完全蛋白酶抑制劑、細(xì)胞裂解液、麗春紅、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)于美國(guó) Sigma－Aldrich公司;ELISA試劑盒購(gòu)于上海依科賽公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司;GAPDH抗體購(gòu)于華安生物公司;AMPK、p－AMPK、Raptor、p－Raptor、mTOR、p－mTOR、P70S6K、p－P70S6K、Akt、p－Akt抗體均購(gòu)于美國(guó) Cell Signaling Technology公司;蛋白預(yù)染Marker、一抗稀釋液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗、ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)于碧云天公司;硝酸纖維素膜購(gòu)于美國(guó)Millipores公司。

1.2 方法

1.2.1 BALB/c小鼠脾細(xì)胞原代培養(yǎng) 配制含10%胎牛血清、110 mg丙酮酸鈉、20 mmol/L HEPES、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的 1 L PRMI 1640培養(yǎng)液(pH 7.2)。處死6～8周小鼠取脾臟，置于冷PBS中，研磨，過(guò)200目篩網(wǎng)，1 200 r/min離心5 min，去上清液，沉淀加入紅裂液1 ml/脾，混勻，靜置1 min，加入PBS離心，再加入PBS，過(guò)膜，1 200 r/min離心5 min，所剩細(xì)胞洗滌1～2次，1 ml 1640打散離心后的沉淀(10 μl細(xì)胞懸液+190 μl臺(tái)盼藍(lán)，取10 μl計(jì)數(shù))。

1.2.2 MTT測(cè)ATG的細(xì)胞毒性 用RPMI 1640將小鼠原代脾細(xì)胞調(diào)成4×106個(gè)/ml，在96孔板中，每孔加 100 μl細(xì)胞懸液(4 ×105個(gè)細(xì)胞)，50 μl培養(yǎng)液和 50 μl ATG(終濃度為 200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L，RPMI 1640 溶解，對(duì)照組為培養(yǎng)液)，各濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)置3個(gè)不加細(xì)胞和藥物(用培養(yǎng)基替代)的調(diào)零孔，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h 加20 μl MTT(母液5 mg/ml)，培養(yǎng)結(jié)束后加入MTT三聯(lián)溶解液，4 h后測(cè)OD 570 nm處波長(zhǎng)。結(jié)果用GraphPad Prism 5軟件作圖，用SPSS 21.0軟件計(jì)算半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(50%cytotoxic concentration，CC50)。

1.2.3 H3－胸腺嘧啶核苷摻入法測(cè)ATG的增殖抑制作用 于96孔板中每孔加入100 μl細(xì)胞懸液(4×105個(gè)細(xì)胞)，50 μl ATG(終濃度為50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μmol/L，RPMI 1640 溶解，對(duì)照組加培養(yǎng)液)和50 μl刀豆蛋白 A(concanavalin，ConA，終濃度20 μg/ml)，總體積200 μl。每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，另設(shè)5孔不加ConA作為細(xì)胞增殖的本底對(duì)照，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，結(jié)束培養(yǎng)前8 h每孔加入H3－TdR 25 μl。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，先在HARVEST上收集細(xì)胞。再在液閃機(jī)(beta－counter)上檢測(cè)。結(jié)果用GraphPad Prism 5軟件作圖、進(jìn)行與對(duì)照組相比的單因素方差分析，用SPSS 21.0軟件計(jì)算半數(shù)細(xì)胞抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)。

1.2.4 ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中白介素2(IL－2)、干擾素 γ(IFN－γ)含量 用 RPMI 1640 將小鼠原代脾細(xì)胞調(diào)成7.5×106個(gè)/ml，于24孔板中每孔加400 μl細(xì)胞懸液(3 ×106個(gè)細(xì)胞)，200 μl ConA(終濃度 20 μg/ml)和 200 μl ATG(終濃度為 25、12.5、6.25 μmol/L，對(duì)照組加培養(yǎng)液)，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，離心1 770 r/min，5 min收集上清液，測(cè)定細(xì)胞因子。根據(jù)依科賽細(xì)胞上清液IL－2、IFN－γ測(cè)定試劑盒指示進(jìn)行測(cè)量。每次測(cè)量樣品，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果用GraphPad Prism 5軟件作圖，SPSS 21.0軟件進(jìn)行與對(duì)照組相比的單因素方差分析。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)mTOR通路相關(guān)蛋白用RPMI 1640將小鼠原代脾細(xì)胞調(diào)成1.2×107個(gè)/ml，于6孔板中每孔加1 ml細(xì)胞懸液(1.2×107個(gè)細(xì)胞)，500 μl ConA(終濃度 20 μg/ml，空白組加培養(yǎng)基)和 500 μl ATG(終濃度為 25、12.5、6.25 μmol/L，對(duì)照組加培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組用終濃度50 μmol/L RAPA替代)，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。使用RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白，BCA蛋白分析試劑盒(Thermo)進(jìn)行蛋白定量，配置統(tǒng)一濃度(1 μg/μl)蛋白溶液。配置SDS－PAGE膠(5%濃縮膠、6%或10%分離膠)，每孔 30 μl，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，按說(shuō)明書(shū)比例(1∶1 000)加入一抗室溫孵育1 h，4℃過(guò)夜，TBST洗10 min×3次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶500)，室溫孵育2 h，TBST洗10 min×3次，ECL顯色，X線(xiàn)片暗室曝光15 min，X線(xiàn)片顯影定影。結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行灰度定量，用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖和與對(duì)照組的單因素方差分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0和GraphPad Prism軟件進(jìn)行分析(圖中的誤差棒均為標(biāo)準(zhǔn)差SD，均來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果)和作圖，數(shù)據(jù)用±s表示。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 ATG對(duì)小鼠原代脾細(xì)胞的作用 通過(guò)MTT測(cè)得ATG在6.25～200 μmol/L之間對(duì)小鼠脾細(xì)胞活性的影響見(jiàn)圖2。ATG對(duì)小鼠脾細(xì)胞毒性的CC50為(4 237.23±1 670.86)μmol/L，表明ATG對(duì)小鼠脾細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性。

圖2 ATG對(duì)小鼠脾細(xì)胞的毒性作用

2.2 ATG對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖抑制作用及IC50測(cè)定 通過(guò)H3－胸腺嘧啶核苷摻入法實(shí)驗(yàn)測(cè)得ATG在3.125～50 μmol/L濃度時(shí)顯著抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖(P＜0.01，F(xiàn)=97.38)，見(jiàn)圖3;并計(jì)算出ATG抑制ConA誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖的IC50為(15.55±6.13)μmol/L。

圖3 ATG對(duì)ConA刺激的小鼠脾細(xì)胞的抑制效應(yīng)

2.3 ATG對(duì)原代培養(yǎng)的小鼠脾細(xì)胞 IFN-γ、IL-2分泌的影響 通過(guò)ELISA測(cè)得ATG在6.25～25 μmol/L濃度時(shí)小鼠脾細(xì)胞上清液中 IFN－γ(P＜0.01，F(xiàn)=67.31)和 IL－2(P ＜0.01，F(xiàn)=38.99)的含量顯著下降，見(jiàn)圖4。

2.4 ATG對(duì)mTOR途徑中相應(yīng)蛋白磷酸化的影響 在給藥24 h之后，與對(duì)照組進(jìn)行比較，ATG顯著抑制了小鼠脾細(xì)胞mTOR(P＜0.01，F(xiàn)=31.26)及下游P70S6K的磷酸化(P＜0.01，F(xiàn)=45.70)，并且在上游激活了AMPK的磷酸化(P＜0.01，F(xiàn)=11.15)，提高了Raptor的磷酸化水平(P＜0.01，F(xiàn)=20.39)，而相應(yīng)非磷酸化蛋白的水平?jīng)]有明顯改變。同時(shí)ATG沒(méi)有明顯改變其上游Akt的磷酸化水平。見(jiàn)圖5。

3 討論

免疫細(xì)胞的過(guò)分激活和增殖常導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)和移植排斥反應(yīng)等嚴(yán)重免疫疾病。本研究顯示隨著ATG濃度的增高，小鼠原代培養(yǎng)脾細(xì)胞的增殖水平明顯地降低，在15.55 μmol/L時(shí)，其增殖水平可降低50%。而細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)則表明這種抑制并不是由ATG的毒性導(dǎo)致的，提示可能由于ATG作用于細(xì)胞中某些與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路，從而導(dǎo)致了細(xì)胞增殖抑制。

用ConA刺激小鼠原代培養(yǎng)的脾細(xì)胞主要激活T細(xì)胞的增殖，IFN－γ、IL－2作為 T細(xì)胞釋放的主要炎性因子，在免疫細(xì)胞群整體的激活增生和募集中有重要的作用［6］。本研究顯示隨著ATG給藥濃度的增高，小鼠脾細(xì)胞上清液中IFN－γ、IL－2的含量明顯降低，一方面提示T細(xì)胞分泌淋巴因子的能力減低，一方面提示小鼠脾淋巴細(xì)胞的激活和增殖受到了抑制。

RAPA是mTOR的特異性抑制劑，具有免疫抑制作用，其衍生物(rapalog)廣泛應(yīng)用于臨床的免疫抑制治療，本研究使用RAPA作為mTOR受抑制的陽(yáng)性對(duì)照［7］。當(dāng)mTOR被抑制時(shí)，其下游的P70S6K也被抑制，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的合成以及細(xì)胞的增殖和活性［8］。本研究顯示ATG顯著降低了小鼠原代脾細(xì)胞中mTOR和P70S6K的磷酸化水平，提示ATG可能通過(guò)減少細(xì)胞周期素、淋巴因子等的蛋白合成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制。

Akt和 AMPK是 mTOR的上游蛋白，作為mTOR上游的細(xì)胞因子和能量感受器，其激活分別促進(jìn)和抑制了 mTOR的磷酸化激活［9－10］。其中AMPK可以通過(guò)TSC1/2/RHEB途徑抑制mTOR的磷酸化，也可以直接磷酸化Raptor而降低mTOR的活性［4］。本研究顯示mTOR上游的AMPK蛋白隨ATG濃度升高發(fā)生顯著的磷酸化激活，AMPK下游的Raptor的磷酸化也相應(yīng)增強(qiáng);但Akt蛋白的改變并不顯著，提示ATG對(duì)小鼠原代脾細(xì)胞mTOR通路的抑制可能是通過(guò)AMPK的激活實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，ATG通過(guò)促進(jìn)AMPK和Raptor的磷酸化，抑制了mTOR/P70S6K的活性，并抑制了淋巴因子IL－2、IFN－γ的分泌和小鼠原代脾細(xì)胞的增殖，為進(jìn)一步深入研究ATG的免疫抑制作用和相關(guān)機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

圖4 ATG對(duì)ConA刺激的小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2含量的影響

圖5 ATG對(duì)mTOR途徑中相應(yīng)蛋白磷酸化的影響

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