黃 達(dá) 李鳴鏑 林 蘭 鄭亞琳 王秋虹

缺血可以引起糖尿病大鼠嚴(yán)重的周?chē)窠?jīng)病變，缺血再灌注能夠進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞軸索變性并導(dǎo)致施萬(wàn)細(xì)胞凋亡［1］。有研究表明，糖尿病周?chē)窠?jīng)組織在缺血再灌注中受損與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其中炎性介質(zhì)表達(dá)水平增高和炎性細(xì)胞黏附浸潤(rùn)是重要因素，但其損傷機(jī)制尚不完全清楚［1～3］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)糖尿病大鼠下肢缺血再灌注后血清、坐骨神經(jīng)組織中細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)的表達(dá)情況以探討周?chē)窠?jīng)缺血再灌注的損傷機(jī)制。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)材料:清潔級(jí)SD雄性大鼠24只，體重290～310g(北京華阜康生物科技股份有限公司提供)，鏈脲佐菌素(Sigma公司)，Rat sICAM-1/CD54 ELISA試劑盒(R＆D Systems公司)，MPO試劑盒(南京建成生物工程研究所)，ICAM-1(G-5)(Santa公司)，7160全自動(dòng)生化儀(日本日立公司)，STAT FAX 2100全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Awareness Technology公司)。

2．模型制備:(1)糖尿病大鼠模型制備:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，從24只SD大鼠中隨機(jī)選擇6只大鼠作為正常對(duì)照組，剩余18只大鼠禁食不禁水12h，次日使用pH 4．2的檸檬酸鹽緩沖液配制濃度為2%的鏈脲菌素(STZ)溶液，按60mg/kg的劑量腹腔注射，72h后使用羅氏血糖儀測(cè)定大鼠尾尖血糖，以隨機(jī)血糖持續(xù)＞16．7mmol/L作為糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)，3只大鼠血糖值未達(dá)標(biāo)，予以剔除，成功造模15只。(2)下肢缺血再灌注模型制備［3～5］:糖尿病大鼠飼養(yǎng)1個(gè)月后，從中隨機(jī)選擇6只大鼠作為糖尿病對(duì)照組，剩余9只糖尿病大鼠作為糖尿病缺血再灌注組，使用3%戊巴比妥鈉麻醉，沿腹壁正中線切開(kāi)長(zhǎng)約3cm切口，鈍性剝離腹主動(dòng)脈和右側(cè)髂總動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈和右側(cè)髂總動(dòng)脈;另沿右側(cè)腹股溝韌帶剪開(kāi)長(zhǎng)約2cm切口，鈍性剝離股動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈，造成大鼠右下肢中-重度缺血，計(jì)時(shí)3h后打開(kāi)動(dòng)脈夾恢復(fù)下肢血供，逐層縫合肌肉，皮膚。手術(shù)過(guò)程死亡2只大鼠，7只造模成功。

3．指標(biāo)檢測(cè):手術(shù)7天后，3組大鼠使用3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3000r/min離心15min分離血清，采用Elisa法檢測(cè)血清sICAM-1水平，比色法檢測(cè)血清MPO水平。截取右側(cè)坐骨神經(jīng)，一部分稱(chēng)重后勻漿，比色法檢測(cè)坐骨神經(jīng)MPO水平，一部分放入10%甲醛溶液中固定，制作石蠟切片后免疫組化染色，200倍顯微鏡下拍照，每個(gè)坐骨神經(jīng)標(biāo)本橫切面和縱切面各隨機(jī)選取3個(gè)視野，橫切面計(jì)數(shù)ICAM-1陽(yáng)性微血管數(shù)，縱切面采用Image-Pro Plus 6．0軟件測(cè)量積分光密度(IOD)。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，對(duì)于符合正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較選擇LSD檢驗(yàn);對(duì)于不滿足正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．血清sICAM-1和MPO水平:糖尿病大鼠下肢缺血再灌注后血清sICAM-1和MPO表達(dá)水平與正常大鼠和糖尿病大鼠比較均明顯升高(P＜0．01)，糖尿病大鼠血清sICAM-1和MPO表達(dá)水平與正常大鼠比較明顯升高(P＜0．01，表1)。

表1 各組大鼠血清sICAM-1和MPO的表達(dá)水平(±s)

表1 各組大鼠血清sICAM-1和MPO的表達(dá)水平(±s)

與正常組比較，*P ＜0．01;與糖尿病組比較，#P ＜0．01

組別 數(shù)量(只) sICAM-1(pg/ml) MPO(U/L)6 2458．40 ±361．62 21．09 ±3．72糖尿病組 6 6371．17 ±515．06* 42．36 ±4．81*糖尿病缺血再灌注組 7 8658．66 ±651．95*# 63．51 ±5．39*#正常組

2．坐骨神經(jīng)ICAM-1和MPO水平:糖尿病大鼠下肢缺血再灌注后坐骨神經(jīng)ICAM-1和MPO表達(dá)水平與正常大鼠和糖尿病大鼠比較均明顯升高(P＜0．01)，糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)ICAM-1和MPO表達(dá)水平與正常大鼠比較升高(P＜0．05，表2、圖1和圖2)。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)ICAM-1和MPO表達(dá)水平(±s)

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)ICAM-1和MPO表達(dá)水平(±s)

與正常組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與糖尿病大鼠比較，#P ＜0．01

組別 數(shù)量(只) 坐骨神經(jīng)橫切面ICAM-1計(jì)數(shù)(條)坐骨神經(jīng)縱切面ICAM-1 IOD值坐骨神經(jīng)勻漿MPO(U/g)0．67 ±0．59 0．56 ±0．35 1．58 ± 0．21糖尿病組 6 2．61 ±1．04* 5．44 ±0．66* 2．33 ±0．21＊＊糖尿病缺血再灌注組 7 7．14 ±2．03＊＊# 26．44 ±7．45＊＊# 4．23 ± 0．30＊＊#正常組6

圖1 3組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面免疫組化ICAM-1表達(dá)(×200)

圖2 3組大鼠坐骨神經(jīng)縱切面免疫組化ICAM-1表達(dá)(×200)

討 論

糖尿病周?chē)窠?jīng)病變是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，與糖尿病周?chē)懿∽兠芮邢嚓P(guān)。糖尿病周?chē)懿∽儾±硖卣鳛閯?dòng)脈粥樣硬化斑塊、血栓形成，造成動(dòng)脈管腔狹窄、閉塞，引起周?chē)窠?jīng)缺血性損傷，在外科手術(shù)治療過(guò)程中常引起周?chē)窠?jīng)缺血再灌注損傷，加重糖尿病周?chē)窠?jīng)病變。在骨外科，肢體骨室筋膜綜合征切開(kāi)減壓后、肢體主要供血?jiǎng)用}斷裂修補(bǔ)后均可引起周?chē)窠?jīng)的缺血再灌注損傷［6］。由于糖尿病患者機(jī)體內(nèi)存在明顯的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，缺血再灌注對(duì)糖尿病患者周?chē)窠?jīng)組織的損傷更為嚴(yán)重，往往引起嚴(yán)重的周?chē)窠?jīng)病變［7，8］。以往研究表明，缺血再灌注引起周?chē)窠?jīng)損傷與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)［3～5］。但并未揭示炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)原理和對(duì)周?chē)窠?jīng)的損傷機(jī)制，對(duì)臨床的指導(dǎo)意義有限，本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)ICAM-1和MPO的表達(dá)水平旨在揭示上述機(jī)制并為臨床治療提供依據(jù)。

ICAM-1是一類(lèi)大小約為(76～114)kDa的細(xì)胞表面單鏈跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，主要介導(dǎo)細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基膜之間的黏附反應(yīng)。靜息狀態(tài)下，ICAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞上呈低水平表達(dá)。炎癥狀態(tài)下，ICAM-1的表達(dá)水平迅速上調(diào)［9］。ICAM-1的受體包括淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)和單核細(xì)胞黏附分子-1(Mac-1)，LFA-1主要介導(dǎo)中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，Mac-1主要介導(dǎo)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)升高會(huì)促進(jìn)炎性細(xì)胞的黏附與浸潤(rùn)［10］。據(jù)此推斷，在缺血再灌注誘發(fā)炎癥反應(yīng)的狀態(tài)下，可能通過(guò)提高血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)水平介導(dǎo)炎性細(xì)胞的黏附與浸潤(rùn)。MPO是由中性粒細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，屬于血紅素過(guò)氧化物酶超家族成員，其表達(dá)水平代表中性粒細(xì)胞的功能狀態(tài)，是評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞在各種組織中浸潤(rùn)程度的可靠指標(biāo)［11］。其主要功能是利用過(guò)氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸鹽，形成具有氧化能力的自由基，在炎癥狀態(tài)下，MPO催化生成過(guò)量的氧化劑，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)和氧化性組織損傷。據(jù)此推斷，缺血再灌注導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)后，可能通過(guò)釋放過(guò)量的MPO參與坐骨神經(jīng)損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，缺血再灌注后糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)ICAM-1和 MPO表達(dá)水平顯著升高，其中ICAM-1定位于坐骨神經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)增強(qiáng)與中性粒細(xì)胞和單核-吞噬細(xì)胞的黏附，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性細(xì)胞釋放過(guò)量的MPO，催化生成大量氧自由基，破壞生物膜，引起坐骨神經(jīng)軸索變性和施萬(wàn)細(xì)胞凋亡。此外發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠比較，糖尿病大鼠血清sICAM-1和MPO表達(dá)水平增高，缺血再灌注能夠進(jìn)一步提高糖尿病大鼠血清sICAM-1和MPO的表達(dá)水平。血清中sICAM-1是由細(xì)胞表面的ICAM-1經(jīng)蛋白酶裂解、脫落進(jìn)入血液而來(lái)，MPO是由中性粒細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞分泌而來(lái)，二者水平可以間接反應(yīng)全身氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)狀態(tài)。由此表明，糖尿病大鼠機(jī)體內(nèi)存在明顯的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)狀態(tài)，缺血再灌注通過(guò)加重機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)造成組織器官損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示臨床上可以通過(guò)使用藥物抑制ICAM-1與MPO的表達(dá)水平以減少下肢缺血再灌注對(duì)坐骨神經(jīng)的損傷，下肢缺血再灌注對(duì)坐骨神經(jīng)的其他損傷機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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