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        不同形式的HIV DNA與疾病進(jìn)展的相關(guān)性分析

        2014-01-28 08:26:54姜太一李紅艷焦艷梅
        傳染病信息 2014年2期
        關(guān)鍵詞:環(huán)狀載量進(jìn)展

        姜太一,李紅艷,張 彤,吳 昊,焦艷梅

        HIV 感染過程中,HIV RNA 基因反轉(zhuǎn)錄為病毒DNA,線狀的雙鏈HIV DNA 以整合前復(fù)合物的形式轉(zhuǎn)到細(xì)胞核內(nèi)。然后,在宿主整合酶的作用下,一些線狀的雙鏈HIV DNA 隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)。也有一些線狀的HIV DNA 未整合進(jìn)宿主內(nèi),在線粒體外形成1 個長末端重復(fù)序列(long terminalrepeat,LTR)和2 個LTR 的環(huán)狀HIVDNA[1-2]。對于環(huán)狀HIV DNA 是否能夠長期穩(wěn)定存在目前尚有爭議。

        HIV RNA 定量是目前評價HIV 感染疾病進(jìn)展的重要指標(biāo),在臨床上被廣泛應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)報道,在HIV 感染早期,外周血中HIV DNA 的水平也可作為預(yù)測疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)[3-5]。這些研究進(jìn)一步說明研究急性期HIV DNA 水平與疾病進(jìn)展的相關(guān)性,有利于進(jìn)一步揭示HIV 的致病機(jī)制。雖然有研究證實HIV DNA 與疾病進(jìn)展密切相關(guān),但哪種形式的HIV DNA 與疾病進(jìn)展關(guān)系最密切目前尚無報道。本研究旨在探討不同形式的HIV DNA 的動力學(xué)變化特點及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系。

        1 對象與方法

        1.1 對象 選擇2006年1月—2012年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院規(guī)律隨診的男同性戀HIV/AIDS 患者,診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《艾滋病診療指南(2011 版)》[6],所有病例均經(jīng)蛋白印跡試驗確證為HIV 感染。共入組48例,均未接受過抗病毒治療。根據(jù)Fiebig 分期評估患者的感染時間[7],并按照評估的感染時間,將患者分為≤60 d 組、60~90 d 組和90~365 d 3 組。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn),所有受試者均于采血前簽署知情同意書?;颊咭话闱闆r見表1。

        1.2 外周全血DNA 提取 采用德國Qiagen 公司生產(chǎn)的DNA 提取試劑盒提取外周血中的DNA,具體操作方法參照試劑盒說明書。

        1.3 實時定量PCR 檢測 采用ABI7900 實時定量儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)、改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone 公司,美國)、聚蔗糖-泛影葡胺分層液(淋巴細(xì)胞分離液,F(xiàn)icoll,天津)和DNA 提取試劑盒(Qiagen 公司,德國)。實時定量PCR 引物及探針的設(shè)計主要參考文獻(xiàn)[8],引物及探針由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司合成,具體引物及探針見表2。PCR反應(yīng)條件:首先95 ℃10 min,然后95 ℃15 s 變性,60 ℃1 min 退火及延伸40 個循環(huán)。

        表1 患者一般情況Table1 General data of the enrolled patients

        表2 所用的引物或探針Table2 Used primers or probes

        1.4 CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)檢測 取新鮮全血50 μl,放入專用的CD4+T 淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)管中,加入CD3-FITC/CD4-PE/CD8-Percp 抗體,混勻后室溫避光孵育15 min,加入450 μl 免洗溶血素,充分混勻,室溫避光15 min 后上機(jī),采用MultiSET 軟件自動計數(shù)系統(tǒng)檢測CD4+T 淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)。

        1.5 血漿HIV 載量的檢測 采用RNA 提取試劑盒提取血漿病毒RNA 后,利用羅氏HIV 定量檢測試劑盒(1.5 版本)檢測HIV 載量,檢測靈敏度為50 copies/ml 血漿。具體RNA 提取及定量檢測操作方法均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5 軟件進(jìn)行分析處理。多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q 檢驗。各種形式的HIV DNA 與CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)及病毒載量之間的相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)性分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 不同形式的HIV DNA 與疾病進(jìn)展之間的相關(guān)性分析 總的HIV DNA 與病毒載量成中等程度正相關(guān)(r=0.485),與CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)呈弱負(fù)相關(guān)(r=-0.386)。整合的HIV DNA 與病毒載量無相關(guān)性,與CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)呈弱負(fù)相關(guān)(r=-0.346)。2 個LTR 的環(huán)狀HIV DNA 與病毒載量和CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)均無相關(guān)性。見表3。

        表3 不同形式的HIV DNA 與病毒載量及CD4+ T 淋巴細(xì)胞計數(shù)的相關(guān)系數(shù)[r(P)]Table3 Correlation coefficient of the different forms of HIV DNA and viral loads and CD4+ T lymphocyte counts [r (P)]

        2.2 病毒載量不同水平組HIV DNA 比較 根據(jù)病毒載量的水平將患者分為3 組:病毒載量>105copies/ml 組(高病毒載量組)、104~105copies/ml 組及103~104copies/ml 組(低病毒載量組),每組各16例。高病毒載量組總的HIV DNA 明顯高于低病毒載量組(P=0.043),其整合的HIV DNA 亦高于104~105copies/ml 組(P=0.032)。2 個LTR 的環(huán)狀HIV DNA在3 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

        2.3 CD4+T 淋巴細(xì)胞不同水平組HIV DNA 比較 根據(jù)CD4+T 淋巴細(xì)胞水平將患者分為3 組:CD4+T淋巴細(xì)胞>500 個/mm3組(高CD4 組)、350~500個/mm3組和<350 個/mm3組(低CD4 組)。低CD4組整合的HIV DNA 明顯高于350~500 個/mm3組和高CD4 組(P 分別為0.027、0.000),其總的HIV DNA 亦高于350~500 個/mm3組和高CD4 組(P 分別為0.048、0.006)。2 個LTR 的環(huán)狀HIV DNA 在3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

        圖1 病毒載量不同水平組HIV DNA 比較Figure1 Comparison of HIV DNA among the groups with different viral loads

        圖2 CD4+ T 淋巴細(xì)胞不同水平組HIV DNA 比較Figure2 Comparison of HIV DNA among the groups with different CD4+ T lymphocyte counts

        2.4 不同感染時間組HIV DNA 比較 ≤60 d 組、60~90 d 組和90~365 d 組3 組間整合的HIV DNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著感染時間的延長,總的HIV DNA 及2 個LTR 的環(huán)狀HIV DNA 均增加。90~365d 組總的HIV DNA 明顯高于60~90 d 組和≤60 d 組(P 分別為0.004、0.035),其2 個LTR 的環(huán)狀HIV DNA 亦高于60~90 d 組(P=0.003)。見圖3。

        圖3 HIV 不同感染時間組HIV DNA 比較Figure3 Comparison of HIV DNA among the groups with different HIV infection time

        3 討 論

        目前,HIV RNA 是評價HIV 感染疾病進(jìn)展及療效的重要指標(biāo)[9]。對于HIV DNA 與疾病進(jìn)展之間的關(guān)系目前研究存在爭議。一些研究認(rèn)為整合的HIV DNA 是與疾病進(jìn)展關(guān)系最密切的指標(biāo)[10];有一些研究則認(rèn)為2 個LTR 的環(huán)狀HIV DNA 與疾病進(jìn)展關(guān)系最密切,是反映病毒復(fù)制的重要指標(biāo)[11];還有一些文獻(xiàn)報道整合的HIV DNA 是反映病毒復(fù)制及疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)[12-14]。研究存在差異的重要原因可能是患者的差異及采用的定量方法不同。在本研究中,我們采用Butler 等[8]報道的對HIV DNA 進(jìn)行定量的方法對48例HIV/AIDS 患者進(jìn)行HIV DNA 檢測。結(jié)果表明,總的HIV DNA 與疾病進(jìn)展的關(guān)系最密切,相反,2 個LTR 的環(huán)狀HIV DNA 與疾病進(jìn)展無相關(guān)性。一些文獻(xiàn)報道2 個LTR 的環(huán)狀HIV DNA 是最新HIV 復(fù)制的標(biāo)志[11],另有文獻(xiàn)報道其半衰期較短,在復(fù)制過程中它不穩(wěn)定[15]。有研究認(rèn)為整合的HIV DNA 是潛伏HIV 存在的重要形式[16]。我們的研究結(jié)果表明,整合的HIV DNA 相對較穩(wěn)定,與疾病進(jìn)展具有一定的相關(guān)性。因為總的HIV DNA 包括了各種形式的HIV DNA,所以單一的某種形式的HIV DNA 與疾病進(jìn)展之間的關(guān)系都是片面的。

        總之,我們的研究發(fā)現(xiàn)總的HIV DNA 與疾病進(jìn)展的關(guān)系最密切,此研究將對于進(jìn)一步揭示不同形式HIV DNA 的作用有重要意義。

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