王進明，范圣此，趙艷，陳婷婷，孫斌，楊霞

（山西振東道地藥材開發(fā)有限公司，山西長治047100）

老翹為木犀科植物連翹 [Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]的干燥果實，果實熟透時采收，曬干，除去雜質，習稱“老翹”[1]。連翹為常用大宗藥材品種以及被列為國家重點保護野生藥材物種，其化學成分復雜多樣，其中主要是苯乙醇及其苷（連翹酚、連翹苷及連翹酯苷 A、B、C、D、E 等）、木質素類（2，3-二芐基丁內酯型木脂素、辛烷型木脂素等）、黃酮類（槲皮素、蘆丁、異槲皮素等）、五環(huán)三萜類（白樺酯酸、齊墩果酸、熊果酸等）、生物堿（物堿suspensineA（1）、（-）-7′-O-methylege 等）及揮發(fā)油[2]等。連翹具有清熱解毒，消腫散結，疏散風熱之功效[3-5]，也是預防和治療非典型性肺炎、禽流感、甲型H1N1流感等流行性疾病的主要成分。雖然以前的一些研究學者對老翹中連翹苷、連翹酯苷A的含量也有些研究，但是他們的研究未明確定義老翹樣品采集時間與取樣方式（如市場購買、山上采集等）等，也沒有對老翹在某個時期內的含量變化進行整體研究比較；此外，老翹的采收期延遲或提前、采收標準不一，導致老翹品質也無法界定，而這些現(xiàn)象在出現(xiàn)如流感等流行性疾病導致老翹價格攀升的年份則尤為嚴重，老翹采收期和采收標準的不確定造成其品質差異較大，這必然導致以老翹為原料的中成藥投料受到影響，進而影響到中成藥制劑的療效。該研究比較了不同采收期老翹果實中連翹酯苷A、連翹苷及浸出物的含量，旨在為中藥老翹的質量控制和老翹適宜采收期的確定提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試老翹。老翹樣品于2012年10月10日開始采集于山西振東集團定植的36株連翹植株，至2013年3月15日結束合計采集11次樣品，每次采集樣品的時間間隔為10 d，并且以固定的每12株為一個混合試驗樣品。連翹植株經(jīng)山西大學張立偉教授鑒定為木犀科植物連翹 [Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]。

1.1.2 儀器與試劑。Aglient1260高效液相色譜儀（四元泵，紫外檢測器，在線脫氣機，柱溫箱）；BSA124S電子天平（賽多利斯科學儀器）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；HY-3A多功能調速振蕩器（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；FW80高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

試驗用水為雙蒸水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；連翹苷對照品（批號：110821-201112，含量為96.8%）、連翹酯苷A對照品（批號：111810-201103，含量為92.9%），供含量測定用，均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 方法

1.2.1 條件。色譜柱為Luna5uC18（2）100A（250 mm×4.6 mm，5 μm），連翹苷測定流動相為乙腈-水（25∶75，V∶V），檢測波長為 277 nm，柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min；連翹酯苷A測定流動相為乙腈-0.4%冰醋酸溶液（15∶85，V∶V），檢測波長為 330 nm，柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min。HY-3A多功能調速振蕩器頻率為125 Hz。

1.2.2 對照品溶液的制備。精密稱取連翹苷對照品11.47 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；精密稱取連翹酯苷A對照14.97 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（臨用配制）。

1.2.3 供試品溶液的制備。連翹苷供試品溶液制備：取老翹不同采收期樣品粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 mL，稱定重量，浸漬過夜，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）25 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，蒸至近干，加中性氧化鋁0.5 g拌勻，轉移至中性氧化鋁柱（100～120 目，1 g，內徑為 1.0～1.5 cm）上，用 70%乙醇 80 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣用50%甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

連翹酯苷A供試品溶液制備：取老翹不同采收期樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 線性關系考察。分別精密量取濃度為1.110 30 mg/mL的連翹苷、1.390 71 mg/mL連翹酯苷A對照品溶液 3、5、8、10、12、15 μL 進樣分析，測定峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得連翹苷回歸方程為（y=2219.4x+591.86，R2=0.9997），表明連翹苷進樣量在3.33～13.32 μg具有良好的線性關系；連翹酯苷A回歸方程為（y=1 771x+599.59，R2=0.999 7），線性范圍在 4.17～6.69 μg具有良好的線性關系。

1.2.5 精密度試驗。精密吸取對照品溶液10 μL，重復進樣5次，連翹苷峰面積的RSD為0.8%，連翹酯苷A峰面積的RSD為0.1%，表明該方法的精密度良好。

1.2.6 重復性試驗。取供試品（同一批號），按供試品溶液的制備方法制備6份供試液，分別進樣10 μL，連翹苷的RSD結果為1.6%，連翹酯苷A的RSD結果為0.3%。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗。精密吸取同一種供試品溶液在0、4、6、8、10、12 h 內重復進樣 6 次，每次 10 μL，計算連翹苷峰面積的RSD值為1.5%，連翹酯苷A的峰面積為0.2%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

1.2.8 加樣回收率試驗。取已測含量的供試品溶液5份，分別精密加入定量的連翹苷、連翹酯苷A對照品，依法測定其結果見表1～2。

表1 連翹苷加樣回收率試驗結果

表2 連翹酯苷A加樣回收率試驗結果

1.2.9 樣品測定。取需要測定供試品，按照第“1.2.3”項方法制備供試品溶液，依法測定，以外標法計算測定結果。

2 結果與分析

2.1 不同采收期老翹中連翹酯苷A測定結果

由表3可以看出，老翹中連翹酯苷A的含量在2012年10月10日采集的樣品中最高，為2.44%，2013年2月25日的樣品最低，為0.16%，同時在2012年12月30日以前的樣品中連翹酯苷A的含量都達到了中華人民共和國2010版藥典標準0.25%的規(guī)定，在以后的幾個樣品測定結果中，連翹酯苷A的含量則達不到藥典的標準。從整個采集老翹樣品中連翹酯苷A含量的測定結果來看，其含量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。

表3 不同采收期老翹中連翹酯苷A、連翹酯苷及浸出物含量%

2.2 不同采收期老翹中連翹苷測定結果

由表3可以看出，連翹苷從老翹樣品采集開始到采集結束的測定結果中均達不到2010版中華人民共和國藥典不得低于0.15%標準的規(guī)定，這與侯莉等[9]采用RP-HPLC法測定不同來源連翹藥材中連翹苷的含量試驗結果中連翹苷含量普遍低于2000版藥典規(guī)定的0.15%結果相一致。在該試驗測定結果中連翹苷含量最高的僅為0.108%，最低的為0.039%，同時在整個老翹采收樣品試驗測定結果中，雖然2012年11月—2013年1月的幾個樣品中連翹苷含量測定趨于平穩(wěn)，但是從整體試驗測定結果的趨勢上看，老翹中連翹苷則呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。

2.3 不同采收期老翹中浸出物測定結果

由表3可以看出，老翹采收樣品中浸出物的測定結果在2013年1月20日之前采收均達到了2010版中華人民共和國藥典規(guī)定不得少于16%的規(guī)定，浸出物含量最高的為2012年10月10日采收的25.32%，最低的為2013年2月25日采收的樣品，為15.63%，而且從整個老翹采集樣品測定結果中可看出浸出物的含量變化與連翹苷、連翹酯苷A同樣呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。

3 結論與討論

老翹為連翹果實熟透時采收、曬干、除去雜質的產(chǎn)品。而長期以來無論是研究學者還是連翹主產(chǎn)區(qū)采收時間與農(nóng)忙季節(jié)的沖突，在老翹采收的時間上都沒有明確的研究結果或標準規(guī)定，有些產(chǎn)地老百姓在老翹的采收時間上從每年的10月份以后持續(xù)到第2年的連翹開花之前，而這種現(xiàn)象特別是在遇到流感年份導致老翹價格大幅上漲時尤為突出，同時老百姓經(jīng)常會將往年不能及時采集、漏采的老翹以及多年由于價格影響沒有出售的老翹摻入新老翹中出售，其中不乏有些百姓遇到高價格年份時摻入連翹枝條出售，而以上這些現(xiàn)象直接導致老翹品質沒有一個統(tǒng)一的考察標準，老翹質量混亂，從而影響到以老翹為原料的中成藥療效，因此，對老翹的采收期和品質標準等研究迫在眉睫[6]。

（1）從以上所有老翹樣品中連翹苷、連翹酯苷A、浸出物3種成分含量的測定結果看，連翹酯苷A與浸出物2種成分在某一個時期內均達到了2010版中華人民共和國藥典的標準規(guī)定，而連翹苷卻在整個采收試驗含量測定結果中始終沒有達到藥典的標準規(guī)定，這表明對老翹的品質進行評價時，連翹苷也許已經(jīng)不能作為老翹品質的一個重要質控指標，同時需對正在修訂的2015版中華人民共和國藥典中老翹的品質評價進行重新修訂。連翹酯苷A不但是從連翹屬植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌活性最強的成分之一，同時也是連翹的主要特征性成分[7-8]，在評價連翹及以抗菌為主要功效的制劑質量時發(fā)現(xiàn)連翹酯苷A優(yōu)于連翹苷，因此建議在對老翹進行品質評價和質控時應以連翹酯苷A和浸出物2種評價指標為主進行評價，或采用多指標成分進行老翹質量的評價更為合適[9]。

（2）從該試驗結果看，老翹中的連翹苷含量在整個采收期的試驗結果中均沒有達到2010版藥典的規(guī)定，如果僅從老翹中連翹酯苷A和浸出物含量這2個指標來考察老翹的品質，則老翹的采收期應該為每年的10月—11月下旬，但在此時期內百姓由于受秋季農(nóng)作物收獲的影響，延遲老翹的采收期，同時也會因延長采收期而給上山采摘人員帶來一定的危險。

（3）在筆者試驗期間常出現(xiàn)降雨、降雪等現(xiàn)象，而該期的老翹也將要開裂或已開裂，這種現(xiàn)象是否為雨水對老翹內部的浸透提供了便利，從而影響到老翹中連翹苷、連翹酯苷A、浸出物3種成分含量的降低，以及這3種成分的含量測定結果在后期出現(xiàn)不同程度的升高后又降低是否與降雪有關，仍需進一步的研究確定。

[1]國家藥典委員會.中國藥典，I部[S].北京：化學工業(yè)出版社，2010：234.

[2]李曉燕.中藥連翹抗菌活性的考察[J].山東醫(yī)藥工業(yè)，1997，16（2）：46.

[3]段文娟，耿巖玲，祝賀，等.中藥連翹化學成分和分析方法的研究進展[J].山東科學，2010，4（23）：2.

[4]張鴻祺.金銀花，桂枝，香薷，連翹，蘆根，麥冬解熱作用的實驗報告[J].山東醫(yī)刊，1960（10）：22.

[5]山西醫(yī)學院肝病研究組.甘草，柴胡，連翹對實驗性肝損傷的作用[J].新醫(yī)藥雜志，1973（9）：21.

[6]李衛(wèi)健，李先恩.連翹果實干物質與有效成分積累規(guī)律研究[J].中草藥，2006，37（6）：921-924.

[7]匡海學，張寧，陸志博.青連翹抗菌活性成分的研究[J].中藥通報，1988，13（7）：32.

[8]胡克杰，徐凱建.連翹酯苷體外抗病毒作用的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥研.究，2001，8（2）：89.

[9]侯莉，王強，任晉斌.RP-HPLC法測定不同來源連翹藥材中連翹苷的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2005，19（1）：48-49.