張子君，劉文奇，李海濤，馬小青，鄒慶道

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，遼寧沈陽110161）

番茄（Solanum lycopersicum）是世界上栽培最為廣泛的蔬菜之一。番茄黃化曲葉病毒?。═YLCVD）是近年來我國(guó)番茄生產(chǎn)上嚴(yán)重發(fā)生的一種新病害，該病害在山東、河北等番茄主栽區(qū)發(fā)病嚴(yán)重，有著從南往北逐步擴(kuò)展的趨勢(shì)，海城等遼南地區(qū)已有該病出現(xiàn)。該病害由煙粉虱傳播、由雙生病毒侵染引起的病毒病，受害植株葉片黃化、矮縮、坐果率降低，給番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失。除農(nóng)藥防治外，應(yīng)用抗病品種是防治該病害經(jīng)濟(jì)有效的防控措施[1-4]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷深入研究，獲得與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)促進(jìn)番茄抗病育種有著重要意義。SCAR標(biāo)記方便、快捷、可靠，可以快速檢測(cè)大量個(gè)體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，與傳統(tǒng)育種相比，這種方法幾乎不受外界環(huán)境的影響，尤其是針對(duì)一些遺傳力較低，易受環(huán)境影響的性狀，其可靠性大大提高[9]。Ji等[5]利用F2分離群體進(jìn)行遺傳分析和QTL定位后，將抗病基因Ty-3定位到6號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，距離Ty-1基因位點(diǎn)約20 cM，該位點(diǎn)的顯性與加性比率是0.47，且是主效基因。與Ty-3連鎖的SCAR標(biāo)記P6-25是可用來鑒定等位基因Ty-3、Ty-3a和Ty-3b的共顯性標(biāo)記，且目前正被廣泛研究[6]。

該研究為獲得與抗病基因Ty-3緊密連鎖的分子標(biāo)記，建立抗病基因Ty-3快速、準(zhǔn)確的分子檢測(cè)體系，從分子水平為番茄黃化曲葉病毒病抗病育種提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

3份抗病純和材料（Ty-3/Ty-3）來自臺(tái)灣亞蔬中心，編號(hào)為 CK1、CK2、CK3；3 份感病材料（ty-3/ty-3）來自遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所番茄課題組，編號(hào)為 CK4、CK5、CK6；抗病 F1代雜交種 7 份，均來自上海種都公司，編號(hào)為29（迪達(dá)），30（迪瑞），31（TY4220），32（迪維斯），33（齊達(dá)利），34（TY4430），35（TY1415），這7份雜交種在2011年上海召開的“全國(guó)抗黃化曲葉病毒病品種展示會(huì)”上均表現(xiàn)抗??；F2代單株28份，編號(hào)為100-127，為經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的33號(hào)雜交種齊達(dá)利自交分離后代。

1.2 方法

1.2.1 特異引物的設(shè)計(jì)?？共』騎y-3SCAR標(biāo)記的引物序列，參照付蓉蓉等[7]設(shè)計(jì)，交由上海生物工程技術(shù)公司合成（表1）。

1.2.2 DNA提取。DNA提取采用改良CTAB法，具體方法及步驟參照邱夷鵬等[8]。

表1 引物序列

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序。

該引物的PCR反應(yīng)總體積為25 μL，模板50 ng，dNTP 1.25 μL，引物（10 U）各 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 （2.5 U/μL）0.5 μL，buffer 2.0 μL，Mg2+1.2 μL。PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。電壓5 V/cm下PCR產(chǎn)物利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳30 min，Goodview染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得與Ty-3基因緊密連鎖的SCAR標(biāo)記

從圖1可以看出，利用特異引物對(duì)6份抗、感材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3份抗病純合材料CK1、CK2和CK3擴(kuò)增獲得600 bp片段，3份感病材料CK4、CK5和CK6獲得320 bp片段。

圖1 6份材料的PCR擴(kuò)增圖譜

2.2 7份抗病雜交種Ty-3基因的檢測(cè)

如圖2所示，在7份F1代雜交種中，編號(hào)為30、31、32、33的4份雜交種經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得600 bp和320 bp兩條帶，說明這4份材料為含有Ty-3抗病基因的雜交種，編號(hào)為29、34、35的3份材料經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得320 bp大小的片段。

圖2 7份抗病番茄F1的PCR擴(kuò)增圖譜

2.3 28份F2代單株抗病基因Ty-3的檢測(cè)

從圖 3 可以看出，101、103、104、106、111、112、113、114、115、116、120、121、125 的 13 個(gè)單株 PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生600 bp和320 bp兩條帶，說明這13份材料為抗Ty-3的雜合體（Ty-3/ty-3）；編號(hào)為107、110、119、123、124、126、127 的 7 個(gè)單株 PCR 擴(kuò)增后只產(chǎn)生600 bp的一條帶，說明這7個(gè)單株為含有抗病基因的的純合體（Ty-3/Ty-3）；編號(hào)為 100、102、105、108、109、117、118、122 的 8 個(gè)單株 PCR 擴(kuò)增后只產(chǎn)生320 bp的1條帶，說明這8份材料不含抗病基因Ty-3，為感病純合材料（ty-3/ty-3）。

圖3 番茄F2材料的PCR擴(kuò)增圖譜

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)利用1個(gè)已獲得的與番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-3緊密連鎖的SCAR標(biāo)記，有效檢測(cè)到番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-3。利用該標(biāo)記對(duì)7個(gè)田間表現(xiàn)抗病的番茄F1代雜交種進(jìn)行檢測(cè)，其中4個(gè)檢測(cè)結(jié)果與田間的抗病表現(xiàn)相一致，另外3個(gè)雜交種沒有檢測(cè)到抗病基因Ty-3，但這3份雜交種在2011年上海種都舉辦的抗TY品種展示會(huì)上均表現(xiàn)抗病，由此推測(cè)這3份雜交種可能不含Ty-3抗病基因，但有可能含Ty-1、Ty-2或其他抗病基因，因此在田間也表現(xiàn)出抗病性；利用標(biāo)記對(duì)來自抗病雜交種齊達(dá)利的28個(gè)F2代分離單株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，有20個(gè)單株含有抗病基因Ty-3，抗病純合體7株，抗病雜合體13株，8個(gè)單株不含抗病基因，由于試驗(yàn)檢測(cè)的F2單株數(shù)量較少，所得的數(shù)據(jù)只能為抗病材料的選擇提供依據(jù)，尚不能對(duì)抗病基因的遺傳規(guī)律進(jìn)行深入分析，還需進(jìn)一步對(duì)所獲得結(jié)果進(jìn)行抗性鑒定。

分子標(biāo)記輔助選擇育種（MAS）現(xiàn)已成為作物育種的有力輔助工具，不僅提高了性狀選擇的準(zhǔn)確性，同時(shí)也加快了常規(guī)育種的進(jìn)程，分子育種技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，是今后育種的方向。

[1]岳寧，丁銘，董家紅，羅延青，等.中國(guó)番茄黃化曲葉病毒在云南的發(fā)生分布及其遺傳多樣性 [J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，30（S1）：57-62.

[2]趙統(tǒng)敏，余文貴，周益軍，等.江蘇省番茄黃化曲葉病毒?。═YLCD）的發(fā)生與診斷初報(bào)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（6）：654-655.

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[5]Ji Y，Schuster D J，Scott J W.Ty-3，a begomovirus resistance locus near the Tomato yellow leaf curl virus resistance locus Ty-1 on chromosome 6 oftomato [J].MolecularBreeding，2007，20：271-284.

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[7]付蓉蓉，劉楊，陳火英.番茄黃化曲葉病的Ty-1和Ty-3抗性基因的 PCR 鑒定[J].分子植物育種（網(wǎng)絡(luò)版），2011，（9）：1647-1652.

[8]邱夷鵬，李海濤，張子君，等.番茄抗晚疫病基因Ph-3的RAPD標(biāo)記[J].園藝學(xué)報(bào)，2009，36（8）：1227-1232.

[9]鄒慶道，吳媛媛，李海濤，等.番茄抗晚疫病Ph-3基因RAPD標(biāo)記的克隆與 CAPS 標(biāo)記的建立[J].植物病理學(xué)報(bào)，2010，41（3）：314-318.