趙 松 張 巖 任 爽 李向楠 朱登彥 趙 佳 黃 琪 吳 彬 盧家奇 吳 愷

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州大學(xué)腫瘤分子外科研究所 鄭州市胸部腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

通過(guò)構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的降鈣素基因相關(guān)膚(CGRP)重組腺病毒載體(Ad5-CGRP-EGFP)，研究腺病毒介導(dǎo)CGRP轉(zhuǎn)基因?qū)σ浦补┓渭?xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料及試劑 河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的20只SPF級(jí)健康Wistar大鼠250～300 g。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定試劑盒和TNF-α、IL-10抗體購(gòu)自Sigma公司。CGRP放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。Ad5-EGFP購(gòu)自廣州生物基因科技發(fā)展有限公司。EGFP克隆基因能在異源組織中表達(dá)并可通過(guò)熒光顯微鏡觀察其產(chǎn)生的熒光，可通過(guò)構(gòu)建Ad5-CGRP-EGFP，觀察CGRP基因表達(dá)。

1.2基因體外轉(zhuǎn)染方法 采用離體供肺靜脈逆行灌注轉(zhuǎn)染空病毒載體和Ad5-CGRP-EGFP。在4℃低鉀石旋糖苷(LPDG)液環(huán)境中，于獲取供肺15 min后開始均勻灌注已用4℃ LPDG液稀釋的空病毒載體和Ad5-CGRP-EGFP。灌注15 min，灌注壓力20 cmH2O。完成灌注后夾閉肺動(dòng)靜脈，將供肺置于4℃ LPDG液保存，移植前以4℃ LPDG液沖洗肺血管床。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 假手術(shù)對(duì)照組5只：直接開胸后游離左肺動(dòng)靜脈及主支氣管，摘除左肺；空白對(duì)照組5只：4℃ LPDG液左肺動(dòng)脈順行灌注、左供肺離體肺靜脈逆行灌注；空載體對(duì)照組5只：4℃ LPDG液左肺動(dòng)脈順行灌注、左供肺離體空病毒載體肺靜脈逆行灌注；基因轉(zhuǎn)染組5只：4℃ LPDG液左肺動(dòng)脈順行灌注、左供肺離體重組腺病毒載體肺靜脈逆行灌注?？瞻讓?duì)照、空載體對(duì)照、基因轉(zhuǎn)染三組供肺均在4℃ LPDG液中保存12 h取材檢測(cè)指標(biāo)。

1.4檢測(cè)指標(biāo) (1)CGRP放射免疫測(cè)定：留取標(biāo)本制成勻漿。4℃ 3 000 r/min離心15 min。取上清液按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肺組織CGRP。(2)ELISA測(cè)定TNF-α、IL-10表達(dá)水平：標(biāo)本制成勻漿，按試劑盒說(shuō)明書方法測(cè)定。(3)基因轉(zhuǎn)染情況觀察：標(biāo)本留取后行冰凍切片，厚約8 μm，用CK40倒置相差熒光顯微鏡在藍(lán)光下觀察標(biāo)本綠色熒光變化。

2 結(jié) 果

2.1放射免疫測(cè)定CGRP 假手術(shù)對(duì)照、空白對(duì)照、空載體對(duì)照、基因轉(zhuǎn)染組分別為0、(1.51±1.15)pg/mg 、(1.66±1.52)pg/mg、(3.91±0.99)pg/mg?；蜣D(zhuǎn)染組較高于空白對(duì)照組、空載體對(duì)照組(P<0.05)。

2.2四組TNF-α水平表達(dá) 空白對(duì)照組〔(8.01±1.22)pg/mg〕、空載體對(duì)照組〔(8.18±1.38)pg/mg〕與假手術(shù)對(duì)照組(0)比較，TNF-α表達(dá)量明顯升高(P<0.01)；基因轉(zhuǎn)染組〔(2.92±1.76)pg/mg〕與空白對(duì)照組、空載體對(duì)照組比較，TNF-α表達(dá)量下降 (P<0.05)。

2.3四組IL-10水平表達(dá)比較 空白對(duì)照組〔(5.02±1.25)pg/mg〕、空載體對(duì)照組〔(5.61±1.19)pg/mg〕與假手術(shù)對(duì)照組比較(0)，IL-10表達(dá)量明顯升高(P<0.01)；基因轉(zhuǎn)染組〔(10.01±0.95)pg/mg〕與空白對(duì)照組、空載體對(duì)照組比較，IL-10表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。

2.4四組基因轉(zhuǎn)染情況 假手術(shù)對(duì)照組、空白對(duì)照組兩組無(wú)綠色熒光表現(xiàn)。空載體對(duì)照組和基因轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)血管內(nèi)膜、中膜、外膜呈現(xiàn)綠色熒光，部分肺組織亦可見(jiàn)綠色熒光，表明已成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)綠色熒光蛋白。

3 討 論

CGRP由37個(gè)氨基酸組成，是應(yīng)用DNA基因重組和分子生物技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)的第一種生物活性多肽，在肺、心血管系統(tǒng)具有重要的生理作用。CGRP對(duì)于肺移植中出現(xiàn)的血管反應(yīng)、炎性病變和免疫反應(yīng)等具有抑制、對(duì)抗作用〔1〕。

臨床肺移植中，細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程中起關(guān)鍵作用，在肺組織低溫缺血前期炎性細(xì)胞因子如TNF-α、干擾素(IFN-γ)等升高，而抗炎性細(xì)胞因子如IL-10、IL-12、IL-18水平下降。TNF-α是參與炎性損傷過(guò)程的重要細(xì)胞因子，可通過(guò)多種途徑引起肺損傷。IL-10是重要的抗炎細(xì)胞因子，一方面能抑制炎性因子的合成和釋放，另一方面直接抑制炎性細(xì)胞的激活、遷移和黏附，與其他抗炎介質(zhì)有協(xié)同作用〔2〕。CGRP作為免疫活性物質(zhì)可上調(diào)IL-10等抗炎性細(xì)胞因子，抑制TNF-α等炎性細(xì)胞因子，減弱抗原呈遞，具有抑制炎癥擴(kuò)散的作用。

本研究表明Ad5-EGFP載體所承載的目的基因CGRP在延長(zhǎng)保存12 h的移植供肺局部獲得明顯的表達(dá)。另外供體外CGRP轉(zhuǎn)基因可減輕供肺炎癥反應(yīng)，可能與其下調(diào)前炎性細(xì)胞因子和上調(diào)抗炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的抗炎效應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，CGRP通過(guò)抑制多核或吞噬細(xì)胞分泌TNF-α等炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)IL-10等抗炎性細(xì)胞因子分泌，抑制炎癥反應(yīng)〔1〕，從而發(fā)揮供體肺保護(hù)的作用。

4 參考文獻(xiàn)

1陳 椿，陳道中，陳春美，等.降鈣素基因相關(guān)肽體外轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠同種異體肺移植物缺血再灌注損傷的影響〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2008;25(11)：1469-71.

2李勁松，聶 君，陳 剛，等.大鼠肺缺血再灌注損傷不同時(shí)期基因表達(dá)譜的改變〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2008;25(2)：200-2.