李繼林 許保軍

（1.江蘇省盱眙縣古桑鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，江蘇淮安 211701；2.江蘇省盱眙縣桂五鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，江蘇淮安 211721）

弓形蟲病是由原生動(dòng)物寄生蟲剛地弓形蟲引起的一種人獸共患性動(dòng)物傳染病。剛地弓形蟲（簡(jiǎn)稱弓形蟲）是一種人獸共患、專性細(xì)胞內(nèi)原生動(dòng)物寄生蟲；它對(duì)所有溫血?jiǎng)游锒加懈腥拘浴?/p>

1 病原鑒定

1.1 病原分離

用接種實(shí)驗(yàn)鼠的方法可以很好地將弓形蟲從流產(chǎn)綿羊和山羊的胎兒及胎膜中分離出來(lái)。最好的接種材料是胎兒腦組織和胎盤子葉，用無(wú)污染的新鮮樣品可得到很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。任何時(shí)候都不能將樣品冰凍，因?yàn)檫@樣會(huì)殺死該寄生蟲。

1.2 組織切片

在死于急性弓形蟲病的動(dòng)物中，許多組織包括肝、心和肺臟有局灶性單核炎癥或伴局部壞死。肺臟有時(shí)有水腫。淋巴結(jié)有時(shí)腫大，可伴有出血性或非出血性壞死。尤其在壞死區(qū)與炎癥區(qū)可檢出弓形蟲速殖子。

1.3 飲水中卵囊檢測(cè)

利用檢測(cè)隱孢子蟲卵囊的方法，已經(jīng)在飲水中檢出了弓形蟲卵囊。該方法需要采集大體積的水樣并將水樣通過柱狀濾器。鑒別弓形蟲卵囊的方法是接種裂齒動(dòng)物。

2 血清學(xué)試驗(yàn)

有多種血清試驗(yàn)可用于檢測(cè)弓形蟲抗體。（1）觀察者是在顯微鏡下判斷速殖子出現(xiàn)的顏色。例如，染色試驗(yàn)（DT）或IFA試驗(yàn)。（2）根據(jù)速殖子、血紅細(xì)胞或膠乳顆粒的凝集原理建立起來(lái)的試驗(yàn)，例如，與它們對(duì)應(yīng)的直接凝集試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)（IHA）和膠乳凝集試驗(yàn)。ELISA是依據(jù)顏色變化的程度來(lái)界定一定溶液中特異性抗體的數(shù)量。

2.1 DT是人弓形蟲血清學(xué)試驗(yàn)的所謂“金標(biāo)準(zhǔn)”

將活弓形蟲速殖子加補(bǔ)體樣輔助因子和加待檢血清在37 ℃孵育1 h，然后加亞甲藍(lán)。特異性抗體使寄生蟲膜具有通透性，致使原生質(zhì)溢出而速殖子不與染料結(jié)合，故呈無(wú)色。未暴露于特異性抗體的（即陰生血清樣品）的速殖子吸收染料而呈藍(lán)色。DT試驗(yàn)對(duì)人弓形蟲檢測(cè)特異而敏感，但對(duì)其他動(dòng)物的弓形蟲檢測(cè)可能不可靠。此外，由于使用活蟲，因此DT具有潛在的危險(xiǎn)性。該試驗(yàn)費(fèi)用大且有很高的技術(shù)要求。值得注意的是，從動(dòng)物福利考慮，速殖子應(yīng)盡可能在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不要在小鼠腹膜內(nèi)培養(yǎng)。

2.2 IFA是一種簡(jiǎn)單而被廣泛使用的方法

完整的滅活的速殖子與經(jīng)稀釋的被檢血清一起孵育，加適量的熒光抗該物種血清，然后用熒光顯微鏡檢查結(jié)果。適用于各種動(dòng)物的熒光素標(biāo)記抗體已商業(yè)化，該方法費(fèi)用較低，且試劑盒可在市場(chǎng)上買到。但是這種方法需要熒光顯微鏡，以肉眼判讀結(jié)果，會(huì)因人而異。找到某些物種特異性軛合物可能較為困難，且存在與風(fēng)濕性因子和抗核抗體交叉反應(yīng)的危險(xiǎn)。

2.3 DAT既敏感又特異

將福爾馬林處理過的速殖子加于U形微量板，然后加進(jìn)稀釋的血清。陽(yáng)性樣品會(huì)凝集并可評(píng)出級(jí)別，而陰性樣品則會(huì)在孔底部產(chǎn)生一個(gè)析出的速殖子“鈕扣”。盡管該試驗(yàn)需要較多的抗原，但是它簡(jiǎn)單且易于操作。市場(chǎng)上有商品試劑盒。后面介紹弓形蟲的培養(yǎng)和收獲方法。市場(chǎng)上也有商品LAT試劑盒。DAT和LAT沒有種特異性，適用于各種動(dòng)物。

最初使用是由弓形蟲RH株速殖子制備的可溶性抗原，置于微量板孔中。待檢血清（如采自綿羊）加進(jìn)后，再加抗物種標(biāo)記酶軛合物如過氧化酶標(biāo)記的抗綿羊IgG。任何粘附的軛合物都引起底物變色，底物顏色變化與直接結(jié)合的抗體量有關(guān)，并可用分光光度計(jì)在對(duì)應(yīng)于所用底物吸收值下判讀。該試驗(yàn)簡(jiǎn)便，可檢測(cè)大數(shù)量樣品，而且用所選種特異性軛合物，操作容易。種特異性軛合物、底物和全套試劑盒均可在市場(chǎng)買到。但該試驗(yàn)需要分光光度計(jì)。

需要分析大量樣品的實(shí)驗(yàn)室很適合使用ELISA。近年來(lái)，一種動(dòng)力學(xué)ELISA（KELA）已經(jīng)被建立。KELA系統(tǒng)測(cè)定結(jié)合酶和產(chǎn)生顏色的底物溶液之間的反應(yīng)率。以每45 s讀一次閱讀3種光密度（OD）（利用KELA數(shù)據(jù)管理程序），以斜率（slope）方式顯示出結(jié)果。ELISA和KELA之間的相關(guān)性非常高，因此，這2個(gè)試驗(yàn)都是非常好的診斷工具，只是它們應(yīng)用的方便性不同。

為了提高常規(guī)ELISA的特異性，使用重組抗原及親和純化的弓形蟲特異抗原的ELISA試驗(yàn)已經(jīng)被建立，可用于綿羊檢測(cè)。但這些試驗(yàn)沒有被常規(guī)應(yīng)用。

以常規(guī)ELISA對(duì)弓形蟲特異抗體IgG和IgM的檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)急性和慢性弓形蟲之間的差異。目前，已經(jīng)建立起親合力試驗(yàn)。由于免疫應(yīng)答發(fā)育成熟，所以，抗原的增加親合力（功能性親合力）抗體在感染發(fā)生之后產(chǎn)生。這種親和力可以被檢測(cè)出來(lái)，并可用于確定弓形蟲感染是活躍期還是初期。一種檢測(cè)綿羊弓形蟲P30抗原的IgG親和力的試驗(yàn)已經(jīng)被建立。這個(gè)試驗(yàn)是一個(gè)將近期感染從更成熟的感染中相對(duì)地區(qū)別出來(lái)的好的診斷工具。

如果被檢血清為陰性，由于伊文思藍(lán)的自發(fā)熒光，全蟲將顯現(xiàn)紅色。它們也可能在其端部出現(xiàn)綠色熒光帽（非特異性極熒光）。如果被檢血清為陽(yáng)性，蟲體將顯現(xiàn)紅色熒光且在該孔中至少80%蟲體被連續(xù)的綠色熒光帶所圍繞。對(duì)于成年綿羊或山羊樣品，可以規(guī)定滴度≥1/64為陽(yáng)性、滴度≤1/32為陰性；對(duì)于綿羊或山羔羊和胎羊血清，則分別為≥1/32和≤1/16。

[1] 鄧茂剛.豬弓形蟲間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)[J].山東畜牧獸醫(yī)，2008，（2）：1-3.

[2] 江濤，何會(huì)時(shí)，聶浩，等.ELISA和LAT檢測(cè)豬血清弓形蟲抗體的比較[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2007，（6）：9-10.

[3] 廖申權(quán)，翁亞彪，宋慧群，等.2例豬弓形蟲病的特異PCR診斷與蟲株分離[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2006，（9）：969-971.