李 強，靳振江，，李忠義，羅 堃，唐志琴，黃靜云，陸文體

（1.國土資源部／廣西巖溶動力學(xué)重點實驗室 中國地質(zhì)科學(xué)院 巖溶地質(zhì)研究所，廣西 桂林541004；2.廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點實驗室 桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林541004；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧530007）

巖溶環(huán)境被視為一種極其脆弱的極端環(huán)境［1］。土壤微生物作為巖溶環(huán)境中的重要組成部分，對土壤肥力、植被生產(chǎn)力和生態(tài)系統(tǒng)功能等具有重要的調(diào)節(jié)作用。此外，微生物作為土壤的重要組成部分，在有機物降解和多種元素的循環(huán)中還起著關(guān)鍵性的作用［2］。由于土壤微生物組成對很多環(huán)境因子都十分敏感，如土壤類型、pH 值、植被和地理距離等［3－6］，因此分析土壤微生物群落變化將有利于揭示其對環(huán)境變化的響應(yīng)［5］。有關(guān)研究表明，在不同的巖溶地貌中，微生物區(qū)系數(shù)量和以微生物為主導(dǎo)的土壤酶活性有較大差異［7］，然而，關(guān)于巖溶地貌形態(tài)以及土壤成因?qū)ν寥牢⑸锶郝浜屯寥烂富钚缘挠绊憴C理還缺乏深入的討論。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是基于熒光定量PCR方法的改進，大大提高了微生物群落豐度檢測的靈敏度，為全面分析微生物群落結(jié)構(gòu)提供了強有力的工具。因此，本文通過研究不同巖溶地貌部位及土壤成因條件下的微生物群落豐度與酶活之間的相互關(guān)系，為揭示巖溶極端環(huán)境下的土壤—微生物之間的響應(yīng)和適應(yīng)機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)選擇在中國地質(zhì)科學(xué)院巖溶地質(zhì)研究所桂林丫吉巖溶試驗場。該試驗場建于1986年［8］，是中國南方裸露巖溶區(qū)具有代表性的峰叢山區(qū)巖溶泉域系統(tǒng)，位于桂林市東南郊區(qū)8km的丫吉村附近，處在峰叢洼地和峰林平原的交界地帶，總面積2km2。

桂林位于亞熱帶季風區(qū)，降雨在季節(jié)分配上的不均勻性是該區(qū)基本的氣候特點。據(jù)桂林市氣象臺32a的觀測資料，多年平均降雨量為1 915.2mm，多年平均水面蒸發(fā)量為1 378.3mm。該區(qū)從9月至翌年3月為旱季，其降雨量僅為年降雨量的29.68%，而4—8月的雨季降雨量占年降雨量的70.32%。在1986年之前，由于當?shù)剞r(nóng)民的砍伐和燒荒，試驗場的生態(tài)環(huán)境受到掠奪性破壞，整個區(qū)域基本沒有植被覆蓋，生境相當嚴酷，為次生裸地。作為試驗場后封山，進行植物群落的自然恢復(fù)，目前群落年齡在18～20a。由于試驗場不同部位水分、光照、熱量及土壤的差異，故選取埡口（25°14′45″N，110°22′55″E，高程407m）；坡地（25°14′50″N，110°23′1″E，高程290m）和1號洼地（25°14′55″N，110°23′3″E，高程272m）3種樣地作為研究樣點。埡口的土壤為殘坡積土，土壤覆蓋度低、水熱變化劇烈，環(huán)境相對惡劣。坡地的土壤為洪積土，土層薄，土壤異質(zhì)性強，溶溝、溶槽發(fā)育，地表徑流易入滲。1號洼地的土壤為沖積土（1級）。此外，洼地還是降水的匯集區(qū)，其水熱條件和土質(zhì)較好，在南方巖溶區(qū)多為耕作區(qū)［9］。

1.2 供試土壤與樣品采集

2010年11月在巖溶試驗場1號洼地、坡地、埡口3種地貌處采集土壤樣品。每個樣地隨機設(shè)置3個近2m2的采樣區(qū)，在每個采樣區(qū)分別選擇3個采樣點。每個采樣點用土鉆采集0—10，10—20和20—30cm深度的土樣，將同一采樣區(qū)3個采樣點的土樣按相同層次等比例混勻，當天帶回實驗室。除去植物殘體和入侵體，一部分過2mm篩，儲放于－80℃低溫冰箱中，以作土壤酶活性和微生物群落豐度分析。

1.3 土壤總DNA提取與熒光定量PCR分析

土壤微生物總DNA提取使用（MP Biomedicals，USA）試劑盒，操作步驟按照說明進行。DNA樣品用微量紫外分光光度計測定濃度后用作PCR擴增的模板DNA。用氨氧化細菌（AOB）指示基因amoA的特異引物對［10］對硝化細菌進行定量PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25μl，其中含有12.5μl的SYBR＠PremixEX TaqTM，上、下游引物（20pmol／μl）各1μL，模板DNA 15ng，用滅菌的去離子水補足至25μL。擴增條件為首先是94℃2min，30個循環(huán)為94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，最后再在72℃延伸5min。用從5.28×101到5.28×105系列10倍稀釋梯度的5次重復(fù)值畫出標準曲線。從標準曲線得到amoA基因的擴增效率為95.2%，R2值為0.94。

1.4 可培養(yǎng)微生物群落數(shù)量

微生物數(shù)量采用平板菌落計數(shù)法［11］進行，其中細菌、真菌和放線菌分別使用牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基、馬?。∕artin）培養(yǎng)基和高氏1號（Gause’1）培養(yǎng)基培養(yǎng)和計數(shù)。計數(shù)結(jié)果均以每克干土中的菌落數(shù)（cfu／g）表示。用以上3大菌群的總數(shù)代表土壤總的微生物數(shù)量。

1.5 土壤酶活性

酶活性的測定參考關(guān)松蔭等［12］的方法，其中蔗糖酶采用3，5—二硝基水楊酸比色法，活性用24h后每克干土中葡萄糖的毫克數(shù)表示；脲酶采用苯酚一次氯酸鈉比色法，用24h后每克干土中銨態(tài)氮的毫克數(shù)表示；堿性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法，活性用2h后每克干土中苯酚的毫克數(shù)表示。

1.6 土壤pH值

土壤pH值的測定參考畢桂英等［13］的方法，采用無CO2蒸餾水作為浸提劑，按照土水1∶0.5的比例混勻后用METTLER TOLEDO S220pH計測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計檢驗

采用SPSS 10對實驗結(jié)果進行相關(guān)統(tǒng)計分析，相關(guān)檢驗為Spearman相關(guān)。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤酶活性、可培養(yǎng)土壤微生物總數(shù)與土壤pH值

微生物在其生命活動過程中，向土壤分泌大量的胞外酶。微生物死亡后，由于細胞的自溶作用把胞內(nèi)酶也釋放至土壤中，推動土壤生物化學(xué)反應(yīng)。因此，土壤酶活性在一定程度上則反映了微生物的活性及其在土壤養(yǎng)分循環(huán)過程中的作用［14－15］。

從圖1—2可以看出，同一地貌條件下的土壤蔗糖酶、脲酶和堿性磷酸酶活性以及可培養(yǎng)土壤微生物總數(shù)在垂直分布上表現(xiàn)出0—10cm土層最高，隨土層深度的增加而降低；而不同地貌條件下同一層位的土壤在埡口、坡地和1號洼地中，其土壤蔗糖酶、脲酶和堿性磷酸酶活性以及可培養(yǎng)土壤微生物總數(shù)一般表現(xiàn)出洼地最高。此外，從表1可以看出，從埡口、坡地到1號洼地同一層位的土壤pH值總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢；而在同一地貌下，隨著土壤深度的增加，土壤pH值逐漸升高，并使土壤始終保持為堿性。

同一地貌中的土壤酶活性與可培養(yǎng)土壤微生物總數(shù)均隨著土壤深度的增加而降低，主要是由以下兩方面的因素造成的：一方面是土壤有機質(zhì)含量隨土層深度增加明顯減少，而土壤酶主要是以物理的或化學(xué)的結(jié)合形式吸附在土壤有機和無機顆粒上，或與腐殖質(zhì)絡(luò)合，加之丫吉巖溶試驗場表層巖溶帶土層較薄導(dǎo)致該區(qū)的灌木叢細根主要分布在土壤表層，并在土壤中由上至下逐漸減少，細根作為根系最活躍的部分，它的分泌物和細胞的脫落能促使酶進入土壤；另一方面，隨著土層深度的增加，通氣狀況越來越差，微生物種類和數(shù)量遞減，導(dǎo)致土壤酶活性減弱［16］。

此外，受降雨及表層巖溶帶坡面流影響，加之埡口、坡地和1號洼地處的土壤來源不同：埡口的土壤為殘坡積土，坡地的土壤為洪積土，而1號洼地的土壤為沖積土（1級）［17］，土壤有機質(zhì)從埡口流失到洼地，并在1號洼地不斷積累，從而造成不同地貌條件下同一層位的土壤酶活性以及可培養(yǎng)土壤微生物總數(shù)逐漸升高。

表層巖溶帶CO2—水—鈣交換過程活躍，而巖溶土壤中的二氧化碳主要來源于：土壤微生物對動植物遺體的分解、植物根系和土壤原生動物的呼吸［18］，因此同一地貌下隨著土壤深度的增加土壤微生物數(shù)量減少、植物根呼吸減弱，導(dǎo)致CO2—水—鈣交換過程在垂直分布上減弱，并造成土壤pH值隨著土壤深度的增加而升高。從埡口、坡地到1號洼地不同地貌條件下同一層位土壤微生物數(shù)量的增加能夠釋放更多的CO2溶解于土壤水而具有侵蝕力，加之巖溶土壤水在非飽和狀態(tài)下其侵蝕力具有積累效應(yīng)，造成土壤pH值隨著海拔高度的降低而降低。

圖1 丫吉巖溶試驗場不同取樣點土壤酶活性

圖2 丫吉巖溶試驗場不同取樣點土壤微生物數(shù)量

表1 丫吉巖溶試驗場不同取樣點土壤pH值

2.2 氨氧化細菌豐度

土壤中AOB豐度結(jié)果從圖3可以看出，AOB主要集中在表層土壤中，并隨著土壤深度的增加而減少；不同地貌形態(tài)下同一層位的土壤AOB豐度從埡口、坡地到1號洼地也表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。

圖3 丫吉巖溶試驗場不同取樣點土壤微生物AOB豐度

在埡口、坡地和1號洼地，同一層位的土壤酶活性、可培養(yǎng)土壤微生物總數(shù)盡管表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，但AOB豐度則表現(xiàn)出相反的趨勢，這說明可能與巖溶地貌類型有關(guān)。首先，目前已知AOB最小的Ks值為1.92μmol／L［19］，土壤pH 值的降低可導(dǎo)致土壤氨分子的減少并限制AOB的生長［20］，從而使同一層位的AOB豐度從埡口、坡地到1號洼地逐漸降低。其次，真核微生物是旱地土壤微生物中的主要類群，而真菌又是真核微生物的主要組成，對底物具有更強的廣譜性，可利用C／N比更為寬幅的底物生長［21］。在桂林丫吉巖溶試驗場隨著生態(tài)恢復(fù)的推進，土壤腐殖質(zhì)含量得到相應(yīng)的增加，該區(qū)真菌的生長得到促進并顯著提高真核微生物的數(shù)量，然而由于地貌部位和土壤成因的差異，導(dǎo)致埡口的C／N為24.48～33.26，坡地的C／N為9.38～17.46，洼地的C／N為15.23～17.06［7］，從而說明C／N的差異也是造成不同地貌形態(tài)下同一層位AOB豐度差異的重要原因。

細菌作為德國和中國典型堿性土壤硝化過程的主要驅(qū)動者［22－23］，對環(huán)境的變化較為敏感，濕潤及近于中性pH值的土壤環(huán)境有利于其生長與繁殖，并對有機碳質(zhì)量要求較高［24］。由于桂林丫吉巖溶試驗場土壤有機碳含量隨土層深度增加明顯減少［7，9，25］，從而影響細菌的生長以及可培養(yǎng)土壤微生物總數(shù)的變化，并造成AOB豐度隨著土壤深度的增加而減少，因而在埡口和1號洼地，土壤微生物總數(shù)與AOB豐度的相關(guān)性極顯著（r分別為0.971和0.958，p＜0.01）。由于坡地土壤主要來源于洪積土，層理不明顯、性質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致土壤微生物總數(shù)隨著深度的增加而降低的趨勢不明顯，土壤微生物總數(shù)與AOB豐度在坡地則沒有相關(guān)性。

2.3 氨氧化細菌豐度與土壤因子的關(guān)系

從表2可以看出，放線菌、AOB豐度與蔗糖酶活性極顯著負相關(guān)（r分別為－0.818和－0.503，p＜0.01），而土壤微生物總數(shù)、細菌和真菌與土壤中的脲酶活性和堿性磷酸酶活性極顯著正相關(guān)（r分別為0.641，0.914，0.651，0.902，0.744和0.476，p＜0.01）。

放線菌由于其菌絲纏繞土壤顆?；蛴袡C質(zhì)，因而對土壤腐殖質(zhì)的合成有重要的促進作用，并且其次生代謝產(chǎn)物能夠改善土壤環(huán)境，有利于植物的生長。然而在巖溶環(huán)境中，高含量的鈣離子使土壤腐殖質(zhì)中胡敏酸的含量比例較高，且穩(wěn)定性好，造成腐殖質(zhì)不易分解，營養(yǎng)元素供給速率緩慢［26］，因而巖溶土壤放線菌的存在能夠促進土壤腐殖質(zhì)的積累并限制蔗糖酶參與土壤有機碳循環(huán)過程，進而造成氨氧化細菌功能豐度降低［27］。因而在本研究中，土壤放線菌、AOB豐度與蔗糖酶活性呈極顯著負相關(guān)。

表2 丫吉巖溶試驗場土壤微生物豐度與酶活性間的相關(guān)系數(shù)

真菌和細菌是土壤微生物的主要組成部分。真菌對枯枝落葉的分解能力極強，是進行腐解作用的主要微生物，并在土壤的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化過程中起著相當重要的作用。而土壤中的細菌幾乎參與了土壤中的所有生物化學(xué)過程，并具有快速生長的能力，能旺盛地分解各種自然物質(zhì)，故在土壤的物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中具有重要的作用。因而土壤中的真菌在參與枯枝落葉的分解過程中能有效促進土壤細菌的生長，使二者呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（r為0.543，p＜0.01）。脲酶能夠促進有機質(zhì)分子中肽鍵的水解，催化土壤有機質(zhì)中的有機態(tài)氮轉(zhuǎn)化為無機態(tài)氮，堿性磷酸酶能夠促進土壤中最難移動和最難被利用的磷元素的釋放，因而細菌和真菌與土壤中的脲酶活性和堿性磷酸酶活性極顯著正相關(guān)。此外，細菌和真菌通過土壤中氮素循環(huán)和碳水化合物轉(zhuǎn)換之間密切的協(xié)同效應(yīng)造成不同巖溶地貌下土壤AOB豐度的差異。該研究結(jié)果與周永強［27］和黃繼川等［28］的研究結(jié)果也是一致的。因此，巖溶地貌部位形態(tài)是影響土壤微生物主要類群（細菌和真菌）與重要功能群（AOB）的數(shù)量、土壤酶活性表達的重要因素。

3 結(jié)論

（1）受地貌部位和土壤成因的影響，同一層位的土壤酶活性、土壤微生物總數(shù)從埡口、坡地到1號洼地呈增加的趨勢，而AOB豐度則呈降低的趨勢。

（2）不同巖溶地貌部位土壤成因的差異以及土壤pH值的變化在影響土壤微生物總數(shù)變化的同時，還造成土壤AOB豐度與真菌數(shù)呈極其顯著的正相關(guān)，而與蔗糖酶活性呈極其顯著負相關(guān)。

致謝：感謝華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院申泰銘博士提供土壤pH值測試數(shù)據(jù)；感謝審稿專家提出寶貴修改意見。

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