陳小鳳，彭 洋，畢嘉琪，姚振江

（廣東藥學(xué)院／廣東省分子流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510310）

金黃色葡萄球菌中mecA基因的檢測及其耐藥相關(guān)性＊

陳小鳳，彭 洋，畢嘉琪，姚振江△

（廣東藥學(xué)院／廣東省分子流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510310）

目的探討mecA基因在臨床分離金黃色葡萄球菌（SA）中的表達(dá)水平與耐藥的關(guān)系。方法收集臨床分離的SA菌株186株，采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并提取DNA，運(yùn)用PCR擴(kuò)增mecA基因。結(jié)果耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢出率為30.65%（57／186），其中56株 MRSA和129株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）中有10株檢出mecA基因陽性；除對(duì)萬古霉素、利奈唑胺敏感外，MRSA對(duì)其他抗菌藥物耐藥率均高于MSSA，攜帶mecA基因的菌株抗菌藥物耐藥率高于不攜帶mecA基因的菌株，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論SA臨床分離菌株中含mecA基因的菌株對(duì)多種抗菌藥物耐藥，可見mecA基因在SA的耐藥機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。

金黃色葡萄球菌；mecA基因；耐藥

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是當(dāng)今抗感染治療的難題，其對(duì)包括甲氧西林在內(nèi)的多種抗菌藥物耐藥，具有多重耐藥性［1］，已引起臨床和實(shí)驗(yàn)室的廣泛關(guān)注［2］。mecA基因是金黃色葡萄球菌（SA）耐藥機(jī)制中的重要基因，掌握臨床分離SA耐藥性與mecA基因的關(guān)系，能給臨床用藥提供參考。本研究分析了廣州某三甲醫(yī)院臨床分離的186株無重復(fù)SA菌株的來源、耐藥監(jiān)測情況并對(duì)其進(jìn)行了mecA基因檢測，以期探討該基因與SA耐藥性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 186株菌株來源于2012年1～12月廣州某三甲醫(yī)院住院患者各種臨床標(biāo)本中分離的SA，標(biāo)本包括痰液、血液、膿液、穿刺液、引流物及胸、腹腔積液等，且無重復(fù)分離株，經(jīng)生物梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（VITEK 2）系統(tǒng)鑒定為SA。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）完成18

種抗菌藥物的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，測試SA對(duì)抗菌藥物的敏感性。實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判讀嚴(yán)格按照美國臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2012年標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 DNA模版制備 根據(jù)文獻(xiàn)［3］提供的方法，在LB肉湯中培養(yǎng)細(xì)菌過夜，離心菌液棄上清液加20mg／mL的溶葡萄球菌酶溶液和20mg／mL的蛋白酶K溫孵（37℃，1h），然后經(jīng)苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，乙醇沉淀取上清液得到純化的DNA。

1.2.3 PCR檢測mecA基因 參照文獻(xiàn)［4］設(shè)計(jì)，用PCR方法擴(kuò)增mecA基因的特異性引物 mecA1：5′-TGG CAT TCG TGT CAC AAT CG-3′；mecA2：5′-CTG GAA CTT GTT GAG GAG AG-3′。擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25μL：2×Taq PCR Master-Mix 12.50μL，10μmol／L引物上下游各1.00μL，雙蒸水8.50 μL，DNA模板2.00μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，55℃ 退火30s，72℃延伸60s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5.00μL點(diǎn)樣于1.50%瓊脂糖凝膠中，80V電泳30min，紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照，以標(biāo)記物100bp LadderⅡ作為參照，陽性標(biāo)本可在約310bp處觀察到電泳條帶。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序 隨機(jī)挑取若干株陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST程序（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／）進(jìn)行比對(duì)確定其均為mecA基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 186株SA對(duì)18種抗菌藥物的耐藥率比較［株（%）］

2 結(jié) 果

2.1 菌株檢出情況 在臨床分離的186株SA中，苯唑西林抑菌環(huán)直徑小于或等于10mm的MRSA有57株（30.65%），≥13mm的 MSSA有129株（69.35%）。

圖1 部分臨床分離株mecA基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 186株SA對(duì)18種抗菌藥物的耐藥率比較 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，186株SA中只有4株對(duì)18種抗菌藥物敏感，僅占全部臨床分離菌株的2.15%，186株SA對(duì)左氧氟沙星、阿莫西林／克拉維酸、克林霉素、青霉素類（青霉素G、氨芐西林）、紅霉素、四環(huán)素的耐藥率較高，表明SA對(duì)這幾類抗菌藥物耐藥情況較為普遍。MRSA對(duì)多類抗菌藥物耐藥率較高，對(duì)青霉素G、苯唑西林高達(dá)100.00%，呈多重耐藥特征；而 MSSA的耐藥率相對(duì)較低，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），未發(fā)現(xiàn)有耐萬古霉素、利奈唑脘的SA。mecA陽性（＋）臨床分離菌株除對(duì)萬古霉素、利奈唑胺敏感外，對(duì)慶大霉素、亞胺培南、環(huán)丙沙星、青霉素G、阿莫西林／克拉維酸、氨芐西林、苯唑西林、復(fù)方新諾明、克林霉素、利福平、氯霉素、四環(huán)素、頭孢唑啉、紅霉素的耐藥性均高于mecA陰性（－）菌株，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；mecA－的菌株均對(duì)復(fù)方新諾明、萬古霉素、利奈唑胺敏感，見表1。

2.3 mecA基因檢測結(jié)果及菌株分布情況 186株SA中檢出mecA基因陽性66株，主要分布在神經(jīng)內(nèi)科（15株）、綜合科（14株）和ICU（7株）等科室；標(biāo)本類型包括痰液47株、各種膿液11株、血液3株和其他5株。在57株MRSA中，56株攜帶mecA基因，占98.25%；部分臨床分離株mecA基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。只有1株MRSA臨床分離菌株未檢測到mecA基因；而在129株MSSA中有10株（7.75%）攜帶mecA基因，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝141.413，P＜0.05）。

3 討 論

目前，SA是引起臨床感染的重要病原菌之一，特別是MRSA感染，正以驚人的速度在世界范圍內(nèi)蔓延和流行，且具有多重耐藥的特點(diǎn)。MRSA產(chǎn)生的主要原因是由于SA通過mecA基因大量表達(dá)一種青霉素結(jié)合蛋白2a（PBP2a），使其與β－內(nèi)酰胺類抗生素不能結(jié)合而產(chǎn)生耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)，mecA基因是SA通過轉(zhuǎn)座機(jī)制獲得的外來基因，且SA較易獲得此基因，故檢測mecA基因可作為 MRSA鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，不同的MRSA，雖然檢測mecA基因陽性，但其耐藥程度卻不盡一致［6－8］。因此，進(jìn)一步研究 MRSA耐藥的分子機(jī)制，減少糖肽類抗生素的使用成為當(dāng)前研究治療MRSA感染的亟待解決的問題。

本研究結(jié)果顯示，在臨床分離的186株SA中，苯唑西林抑菌環(huán)直徑小于或等于10mm的MRSA有57株（30.65%），≥13mm的 MSSA有129株（69.35%）。低于文獻(xiàn)［9-10］報(bào)道的MRSA在50.0%以上水平。186株SA臨床分離MRSA的檢出率為30.65%，藥敏結(jié)果顯示，MRSA對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率均高于MSSA，且兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與劉玉枝等［11］報(bào)道相似，可見 MRSA耐藥非常嚴(yán)重，可用于臨床治療的抗菌藥物種類越來越少。57株MRSA中，56株攜帶mecA基因，占98.25%（56／57）；而在129株 MSSA 中有10株攜帶mecA基因，與陳慶增等［12］報(bào)道相似，攜帶mecA菌株對(duì)14種抗菌藥物的耐藥性均高于不攜帶mecA菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），由此可以發(fā)現(xiàn)攜帶mecA基因的在SA的耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。雖然有1株MRSA未檢出mecA基因，但其顯示對(duì)苯唑西林耐藥，可能是由于β－內(nèi)酰胺酶及青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）產(chǎn)生過多或PBPs的修飾所導(dǎo)致［13］。而10株檢出mecA基因但對(duì)苯唑西林敏感的菌株，有可能與β－內(nèi)酰胺類接觸后，可轉(zhuǎn)化為耐β－內(nèi)酰胺類抗生素菌株，故應(yīng)把攜帶有mecA基因的菌株，歸為 MRSA［14－15］。因此，采用分子生物學(xué)方法檢測mecA基因的存在情況來鑒定MRSA是目前較理想的方法。盡管未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬古霉素耐藥的菌株，但186株SA中只有4株對(duì)18種抗菌藥物敏感，僅占全部臨床分離菌株的2.15%，提示SA臨床分離菌株存在嚴(yán)重的耐藥性。

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Detection of mecA gene in Staphylococcus aureus and its correlation with drug-resistance＊

ChenXiaofeng，PengYang，BiJiaqi，YaoZhengjiang△
（GuangdongPharmaceuticalUniversity／GuangdongProvincialKeyLaboratoryof MolecularEpidemiology，Guangzhou，Guangdong510310，China）

ObjectiveTo investigate the mecA gene expression lvevl in clinically isolated Staphylococcus aureus（SA）strains and its correlation with drug resistance.MethodsClinically isolated 186SA strains were collected.The K-P method was adopted to conduct the durg sensitivity test.Then DNA of these strains was extracted and the mecA gene was amplified by using PCR.Results

The detection rate of methicillin-resistant SA（MRSA）was 30.65%（57／186），the positive mecA gene was detected in 56strains of MRSA and 10strains of methicillin susceptible S.aureus（MSSA）among 129strains of MSSA；except susceptible to vancomycin and linezolid，the resistance rate of MRSA to ther antibacterial durgs were higher than that of MSSA，the resistance rate to antibacterial durgs in the strains carrying mecA gene was higher than that in the strains without carrying mecA gene，ther difference between them had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionClinically isolated SA strains carrying mecA gene are resistant to multiple antibacterial drugs，which indicating that mecA gene play an important role in SA drug-resistance mechanism.

staphylococcus aureue；mecA gene；drug resistance

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.11.011

A

1671-8348（2014）11-1312-03

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（S2011010002481）。

陳小鳳（1987－），在讀碩士研究生，主要從事分子流行病學(xué)研究?！?/p>

，Tel：（020）34055806；E-mail：zhjyao2001＠yahoo.com。

2013-09-28

2013-11-30）

論著·基礎(chǔ)研究