周海豐，范玉宏，武雪亮，孫喜斌，王立坤，梁晚平△，劉運(yùn)江

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血管腺體外科，河北張家口 075000；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北張家口 075000；4.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，河北張家口 075000；5.河北省腫瘤醫(yī)院乳腺中心，河北石家莊050000）

IHC和FISH檢測乳腺癌組織HER-2基因擴(kuò)增及蛋白表達(dá)＊

周海豐1，范玉宏1，武雪亮2，孫喜斌3，王立坤4，梁晚平1△，劉運(yùn)江5

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血管腺體外科，河北張家口 075000；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北張家口 075000；4.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，河北張家口 075000；5.河北省腫瘤醫(yī)院乳腺中心，河北石家莊050000）

目的分析比較熒光原位雜交（FISH）與免疫組織化學(xué)（IHC）檢測乳腺癌組織HER-2基因擴(kuò)增或蛋白表達(dá)情況。方法選擇2008年1月至2012年5月行改良根治術(shù)的乳腺癌患者110例，對手術(shù)切除的乳腺癌組織均予以FISH與IHC檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果110例乳腺癌組織中 HER-2蛋白表達(dá)為（＋＋＋）者25例（22.73%）；（＋＋）者44例（40.00%）；（＋）者26例（23.64%）；（－）者15例（13.64%）。110例乳腺癌組織中 HER-2基因擴(kuò)增28例（25.45%），無擴(kuò)增82例（74.55%）。IHC檢測陽性（＋＋＋）與FISH的陽性符合率一致，IHC檢測陰性（＋／－）與FISH的陰性符合率一致，IHC檢測可疑陽性（＋＋）與FISH結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但I(xiàn)HC檢測結(jié)果與FISH檢測結(jié)果的總符合率為89.29%（25／28），兩種檢測方法呈正相關(guān)（χ2＝84.89，P＜0.01）。結(jié)論IHC陽性及陰性表達(dá)，與FISH檢測結(jié)果具有較好一致性。IHC可疑陽性表達(dá)，與FISH檢測結(jié)果的一致性較差，提示IHC檢測可疑陽性標(biāo)本需再以FISH檢測。

基因，erbB-2；原位雜交，熒光；免疫組織化學(xué)

乳腺癌作為女性常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重地威脅到婦女的生命健康。臨床上對于乳腺癌的治療遵循著早發(fā)現(xiàn)，早診斷的原則［1］。然而，預(yù)后卻始終受到多方面因素的影響。HER-2作為乳腺癌治療的重要因子，其過度表達(dá)或基因擴(kuò)增直接關(guān)系到患者的激素、化學(xué)治療效果以及預(yù)后，對臨床治療有重要的意義［2－3］。本文通過對110例行改良根治術(shù)的乳腺癌患者資料，分析比較熒光原位雜交（FISH）與免疫組織化學(xué)（IHC）檢測乳腺癌組織HER-2基因擴(kuò)增或蛋白表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科2008年1月至2012年5月行改良根治術(shù)的乳腺癌患者110例，均為女性，年齡32～69歲。采用惡性腫瘤診療規(guī)范乳腺癌病理分類：其中浸潤性導(dǎo)管癌33例，浸潤性小葉癌14例，髓樣癌21例，小管癌10，導(dǎo)管內(nèi)癌18例，原位癌14例。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者62例。腫瘤直徑小于2cm者39例，2～5cm者63例，大于5cm者8例。所有標(biāo)本采用10%甲醛進(jìn)行固定，石蠟包埋，標(biāo)本組織切片厚度以4～5μm為準(zhǔn)。110例患者在術(shù)前均未接受任何治療。

圖1 IHC檢測HER-2蛋白（＋＋＋）

圖5 FISH檢測HER-2基因擴(kuò)增陽性

圖6 FISH檢測HER-2基因擴(kuò)增陰性

1.2 方法

1.2.1 IHC檢測 本次實(shí)驗(yàn)采用IHC，其中兔抗人 HER－2多克隆抗體購自武漢博士德公司。一抗工作濃度為1∶100，二抗為1∶200。標(biāo)本統(tǒng)一行IHC鏈霉菌抗生物蛋白－過氧化物酶連結(jié)法（SP）實(shí)驗(yàn)，SP與3，3-二氧基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒均購自北京中山金橋公司，按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.2.2 FISH檢測 FISH是用于17號染色體著絲粒和HER-2基因擴(kuò)增情況下乳腺癌診斷的一類新技術(shù)，與IHC相比更為準(zhǔn)確，被認(rèn)為是HER-2基因監(jiān)測的金標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：（1）提取細(xì)胞核，從石蠟包埋組織中提取細(xì)胞核，對包埋組織進(jìn)行HE染色；顯微鏡下確定腫瘤細(xì)胞的密集部位，石蠟切片，厚度以20μm為準(zhǔn)。（2）細(xì)胞核陣列制作，利用細(xì)胞陣列技術(shù)將ICH檢測中HER-2陰性標(biāo)本的血細(xì)胞排列在同一張切片上。（3）FISH，細(xì)胞陣載玻片浸入固定液體中固定1h，取出在25℃中干燥；置入pH＝6.0的檸檬酸鹽緩沖液中微波加熱10min；置入2×SSC溶液中，37℃，15min；0.4%胃蛋白酶中適當(dāng)消化；分別用70%、85%、100%乙醇脫水處理2min；置入45～50℃烤箱中蒸發(fā)乙醇；加入10μL HER-2／neuDNA探針；封口膠封閉，37℃孵育6～15h；清洗探針，行4′，6-二脒基－2-苯基吲 哚 二 鹽 酸 鹽 （4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色。

1.2.3 陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) 以細(xì)胞膜呈現(xiàn)清晰棕褐色或棕黃色為陽性。HER-2定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，按照陽性細(xì)胞百分比定性。3位研究人員對結(jié)果進(jìn)行判讀，每張切片至少觀察10個(gè)高倍視野（400倍）中大于或等于500個(gè)細(xì)胞。采用DAKO HerceptTest評分系統(tǒng)：（－）表示無細(xì)胞染色或少于10%細(xì)胞膜較弱染色；（＋）表示10%腫瘤細(xì)胞膜部分較弱染色；（＋＋）表示10%腫瘤細(xì)胞膜完全較弱或中等染色；（＋＋＋）為大于10%的腫瘤細(xì)胞膜完全強(qiáng)染色。按照陽性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞的比例行半定量分級：陽性反應(yīng)小于10%為（－），10%～30%為（＋）。＞30%～50%為（＋＋），＞50%為（＋＋＋）。以（－）、（＋）及（＋＋）計(jì)入陰性表達(dá)，（＋＋＋）記為陽性表達(dá)［4］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，HER-2與臨床病理指標(biāo)關(guān)系的比較，采用行X列表進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IHC檢測結(jié)果 110例乳腺癌組織中HER-2蛋白表達(dá)為（＋＋＋）者25例（22.73%），（＋＋）者44例（40.00%），（＋）者26例（23.64%），（－）者15例（13.64%），見圖1～4。2.2 FISH檢測結(jié)果 110例乳腺癌組織中HER-2基因擴(kuò)增28例（25.45%），無擴(kuò)增82例（74.55%），見圖5～6。

2.3 兩者結(jié)果比較 本組實(shí)驗(yàn)中IHC檢測（＋＋＋）后行FISH 檢測的符合率為96.00%（24／25），IHC檢測（＋＋）后行FISH 檢測 的 符 合 率 為 4.55%（2／44），IHC 檢 測 （＋）后 行FISH 檢測的符合率為96.15%（25／26），IHC檢測（－）后行FISH檢測的符合率為93.33%（14／15）。即IHC檢測陽性（＋＋＋）與FISH的陽性符合率一致，IHC檢測陰性（＋／－）與FISH的陰性符合率一致，IHC檢測可疑陽性（＋＋）與FISH結(jié)果的一致性較差。但I(xiàn)HC與FISH檢測結(jié)果的總符合率為89.29%（25／28），兩種檢測方法呈正相關(guān)（χ2＝84.89，P＜0.01），見表1。

表1 110例乳腺癌樣本IHC與FISH結(jié)果比較（n）

續(xù)表1 110例乳腺癌樣本IHC與FISH結(jié)果比較（n）

3 討 論

國內(nèi)外在研究HER-2基因表達(dá)方面的實(shí)驗(yàn)或臨床的文獻(xiàn)都普遍存在樣本容量較小的問題［5］，部分還出現(xiàn)了結(jié)論不一致甚至相悖的現(xiàn)象，對于HER-2檢測主要靠顯微鏡等設(shè)備來觀察，很大程度上局限于觀察者個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)和狀態(tài)，同時(shí)檢測結(jié)果也并沒有標(biāo)準(zhǔn)、客觀的依據(jù)，對于HER-2基因檢測方法的選擇依舊存在較大的爭議，盡管IHC檢測應(yīng)用范圍較廣，但卻存在明顯的不足，而FISH的應(yīng)用卻因價(jià)格問題遲遲得不到定論［6］。而針對IHC和FISH法在HER-2基因檢測中的優(yōu)劣勢比較，可分析此兩種檢測方法的差異所在，完善HER-2實(shí)驗(yàn)室檢測的標(biāo)準(zhǔn)，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率，力求為臨床提供一種簡便、便宜、準(zhǔn)確、迅速的檢測方式［7－8］。

IHC因有組織標(biāo)本所需量小、操作簡便、要求不高、價(jià)格低廉、實(shí)驗(yàn)過程短、染色片易于保存、閱片快等優(yōu)勢，使得其仍為評價(jià)HER-2狀態(tài)的首選檢測方法［9－10］。雖然IHC具有上述優(yōu)勢，但因標(biāo)本處理中使得蛋白容易破壞等因素使得IHC的準(zhǔn)確性易受到影響。FISH有別于IHC的主要特點(diǎn)為結(jié)果的定量判讀，其避免了主觀上的誤差，且有高度的可靠性與重復(fù)性［11］。聶克克等［12］研究表明，F(xiàn)ISH 檢測 HER-2蛋白有很高的假陽性及假陰性，F(xiàn)ISH有效性及準(zhǔn)確性顯著高于IHC，可在臨床廣泛推廣應(yīng)用。HER-2基因擴(kuò)增與腋窩淋巴結(jié)陽性相關(guān)。韓曉紅等［13］研究表明，F(xiàn)ISH和IHC兩種方法檢測HER－2表達(dá)狀態(tài)具有較高的一致性，結(jié)合實(shí)際情況包括費(fèi)用儀器等限制，在IHC作為初篩的基礎(chǔ)上，仍然推薦FISH作為檢測HER-2基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法。FISH技術(shù)檢測乳腺癌患者HER-2基因表達(dá)狀態(tài)可為臨床指導(dǎo)用藥和預(yù)后評價(jià)提供更可靠的依據(jù)。張宏等［14］研究表明，IHC可作為篩查乳腺癌患者HER-2的首選方法，當(dāng) HER-2蛋白表達(dá)為（－）或（＋＋）時(shí)，IHC和FISH檢測的一致性較高；而對于IHC為（＋）或（＋＋）的患者應(yīng)再進(jìn)行FISH檢測，以確定HER-2基因表達(dá)。宋寶等［15］研究表明，F(xiàn)ISH較IHC檢測HER-2表達(dá)準(zhǔn)確性更高，尤適用于對IHC（＋＋）的患者判斷HER-2的表達(dá)。乳腺癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間HER-2的表達(dá)存在一定的不一致性，本文研究結(jié)果表明，IHC檢測陽性（＋＋＋）與FISH的陽性符合率一致，IHC檢測陰性（＋／－）與FISH的陰性符合率一致，IHC檢測可疑陽性（＋＋）與FISH結(jié)果的一致性較差。但I(xiàn)HC與FISH檢測結(jié)果的總符合率為89.29%（25／28），兩種檢測方法呈正相關(guān)（χ2＝84.89，P＜0.01）。

綜合上述，IHC陽性及陰性表達(dá)，與FISH檢測結(jié)果具有較好一致性。IHC可疑陽性表達(dá)，與FISH檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示IHC檢測可疑陽性標(biāo)本需再以FISH檢測，而陽性與陰性標(biāo)本可無須再檢。

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Fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry for detecting HER-2 gene amplification and protein expression in breast cancer tissue＊

ZhouHaifeng1，F(xiàn)anYuhong1，WuXueliang2，SunXibin3，WangLikun4，LiangWanping1△，LiuYunjiang5
（1.DepartmentofBreastSurgery，F(xiàn)irstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000China；
2.DepartmentofVascularGlandSurgery，F(xiàn)irstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000China；
3.DepartmentofClinicalLaboratory，F(xiàn)irstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000China；
4.DepartmentofUltrasound，F(xiàn)irstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000China；
5.DepartmentofBreastSurgery，HebeiProvincialTumorHospital，Shijiazhuang，Hebei050000China）

ObjectiveTo analyze and compare the fluorescence in situ hybridization（FISH）and immunohistochemical（IHC）for detecting HER-2gene amplification and protein expression in breast cancer tissues.Methods110cases of breast cancer from January 2008to May 2012receiving the modified radical mastectomy were selected.The resected breast cancer tissue was detected by FISH and IHC and the detected results were performed the comparative analysis.ResultsAmong 110cases of breast cancer tissue，25cases（22.73%）were the HER-2protein expression（＋＋＋），44cases（40.00%）were（＋＋），26cases（23.64%）were（＋）and 15cases（13.64%）were（－）.Among 110cases，the gene amplification was in 28cases（25.45%）and no gene amplification was in 82cases（74.55%）.The positive（＋＋＋）of the IHC detection was coincident with that of FISH，and the negative（＋／－）of the IHC detection was also coincident with that of FISH，there was statistical difference between the suspicious positive of the IHC detection and the results of FISH（P＜0.05）.But the total coincidence of the IHC detection results and FISH test results was 89.29%（25／28），and the two detection methods had the positive correlation（χ2＝84.89，P＜0.01）.ConclusionThe positive and negative expression of the IHC detection has better consistency with that of the FISH detection.However，the coincidence of the IHC suspicious positive expression and the FISH results is poor，indicating that the suspicious positive sample of the IHC detection needs to be detected by the FISH detection.

genes，erbB-2；in situ hybridization，fluorescence；immunohistochemistry

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.11.007

A

1671-8348（2014）11-1299-03

河北省科技廳指導(dǎo)性計(jì)劃資助項(xiàng)目（08276101D-70）。

周海豐（1979－），主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事乳腺疾病診治與基礎(chǔ)研究?！?/p>

，Tel：15530396549；E-mail：DM96989＠eyou.com。

2013-09-10

2013-12-17）

論著·臨床研究