劉翠紅 李紅軍

（章丘市中醫(yī)醫(yī)院病理科，山東 章丘 250200）

腫瘤的侵襲與轉移是醫(yī)學研究的熱點之一。近些年來，隨著科技的發(fā)展，人們生活水平的不斷提高，但是，科技的發(fā)展造成環(huán)境的惡化，患胃腸癌的患者呈上升趨勢，惡性腫瘤起病不明顯，微小癌灶的浸潤和轉移難以及時探查和治療，胃癌嚴重威脅人類健康和人的生命[1,2]。專家和學者不斷加深對胃癌侵襲、轉移分子機制的研究，nm23基因家族的成員之一—— nm23H1基因，作為一種重要的腫瘤轉移抑制基因，nm23基因與胃癌關系的研究不斷深入，闡明nm23H1基因遺傳不穩(wěn)定性與胃癌、結腸癌進展的關系，為臨床治療提供實驗依據。對腫瘤浸潤及轉移的機制進行研究，關鍵是需要對可靠的預后指標和治療靶點的精確建立[3]。在腫瘤進展和轉移的研究中發(fā)現，腫瘤的浸潤與轉移主要源于腫瘤細胞內，隨著抑癌蛋白的不斷減少，對腫瘤細胞生長與轉移的抑制能力，開始不斷減弱并消失。P53、P16抑癌基因的失活造成了編碼蛋白量的減少。在抑癌基因失活的機制研究中，發(fā)現基因的遺傳不穩(wěn)定性改變，即微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instablility，MSI）和雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH），是基因突變，抑癌基因功能失調的主要原因，因此腫瘤得以生長。

1 組織標本與方法

人類某些惡性腫瘤如胃癌及結腸癌等均證實nm23H1基因表達與腫瘤轉移或預后聯(lián)系密切。但至今未見到其是否與胃腸癌的淋巴結轉移和預后有關。胃腸癌在我國發(fā)生有上升的趨勢，該病且具有淋巴轉移早，預后不良的特點。

1.1 組織標本

標本來自我院外科2012年2月至2013年6月胃癌和結腸癌術后存檔石蠟標本，不計術前行放療或化療的患者，共計35例。其中男性27例，女性8例，年齡22～75歲，平均47.9歲。腫瘤部位：胃癌20例，結腸癌15例。所有標本均再次復查、確診，35例均為鱗狀細胞癌，按WHO1971年標準病理分級：1、2、3級分別為16、10、9例，臨床分期采用UICC1987年公布的標準：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為8、9、8、10例。手術采取切除根治術，術后經病理確診有腹部淋巴結轉移15例，占42.9%，術后失訪2例，隨訪32例中，生存11個月以上30例，占93.8%，術后6個月內死亡2例，占6.2%。

1.2 方法

標本按4 μm厚連續(xù)切片，分別行nm23H1免疫組化染色及HE染色，免疫組化試劑盒，取米粒大小胃、腸組織，使用美國Maxim公司基因組DNA提取試劑盒，提取胃、腸組織基因組DNA，-20 ℃冰箱凍存，以說明書內容進行規(guī)范操作，以PBS代替一抗作陰性對照。參照王修海等的方法略有改進。取PCR擴增產物5 μL，加入等體積變性液（9.8 g/LCAS NO：75-12-7，10 mmol/L NaOH，20 mmol/L EDTA，0.5 g/LCAS NO：115-39-9，0.5 g/LCAS：2650-17-1），加入等體積的蔗糖溶液（100 g/L），混勻后98 ℃變性10 min；迅速置于-20 ℃冰箱10 min；全部上樣于60 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳（丙烯酰胺∶N，N'甲叉雙丙烯酰胺=29∶1），使用TBE工作液（0.5×）：45 mmol/L Tris-硼酸鹽作為電泳緩沖液，它在應用前稀釋，并用同一貯存液制備凝膠溶液和電泳緩沖液（pH8.0），恒壓160 V，15 mA，室溫電泳4 h，凝膠用5 g/L AgNO3染色，觀察結果并照相記錄。

1.3 結果測定

棕黃色顆粒為陽性信號，定位在癌細胞胞質中，隨機選取5個高倍視野（×400）計數陽性細胞比例，陽性細胞＜30%，為低表達，定為陰性；陽性細胞≥30%為高表達，定為陽性。

1.4 SSCP統(tǒng)計分析

采用χ2檢驗。

2 結果

測定35例切片中，陽性率60%，有21例呈陽性表達。nm23H1基因在癌中的表達，即陽性產物主要位于胞質中，部分胞核、胞膜上亦有表達。

nm23H1表達與胃腸癌臨床病理特征及預后的關系：經測定可見，nm23H1表達與患者性別、年齡及臨床分期關系并無明顯表示。但是，隨胃腸癌病理分級的升高，nm23H1陽性率開始有降低的趨勢，但P＞0.05，即差別并無統(tǒng)計學意義。在腹部淋巴結轉移的胃腸癌組織中，nm23H1陽性率分別為52.97%和21.76%，P＜0.05存在顯著差異。術后生存＞6個月組中nm23H1陽性率（56.27%）較＜6個月組（18.03%），高出很多，P＜0.05。

3 討論

nm23H1基因早在20世紀80年代末由美國國立癌癥研究所的STEEG等就克隆和鑒定出來了，主要來自小白鼠的不同轉移潛能的惡性黑色素瘤細胞系K1735，其mRNA水平在低轉移的癌細胞，比高轉移癌細胞高10倍之多，將nm23基因導入高轉移鼠黑色素癌細胞，可以大大降低了癌細胞的轉移表型[4,5]。當前，nm23位基因缺失現象，普遍存在與人類的乳腺癌、肝癌、胃癌及結腸癌中，nm23等位基因的缺失與癌細胞的轉移存在較密切的關系。世界各國經研究一致認為nm23基因是最具代表性的腫瘤轉移抑制基因[6]。

原發(fā)性胃腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，目前有效的治療方法并不明確，患者死亡的重要原因就是腫瘤細胞的轉移。近年來通過分子克隆技術發(fā)現一類參與調控腫瘤轉移的基因——轉移抑制基因。這類基因的失活、突變或表達異常，可導致腫瘤的轉移。經試驗研究發(fā)現，轉移抑制基因nm23基因與腫瘤轉移的關系最緊密。nm23基因可以較明確地抑制腫瘤細胞轉移潛能，但對nm23基因抑制腫瘤轉移的機制，還需要進一步研究。臨床研究發(fā)現，胃腸癌的發(fā)生和轉移與nm23基因缺失或表達降低關系密切。對研究nm23H1基因在胃癌轉移中的作用，主要通過免疫組織化學的方法檢測nm23H1，已經發(fā)現了mRNA的表達及NDPK的變化，但對nm23H1基因突變的研究還在進行中。

[1]盧海英,張國強,李繼承.中國人原發(fā)性膽囊腫瘤nm23H1基因遺傳不穩(wěn)定性的研究[J].分子細胞生物學報,2006,39(3):249-253.

[2]劉義春,王武.抑癌基因nm23H1與腫瘤轉移的研究進展[J].中國現代醫(yī)生,2010,48(22):12-13.

[3]康向東,張隆,吳蓉,等.阻抑素在胃腸癌中的表達情況及其臨床意義[J].檢驗醫(yī)學,2006,21(6):610-612.

[4]王軼淳,孫明軍,傅寶玉.胃癌組織中β-catenin及nm23H1的表達及其臨床意義[J].世界華人消化雜志,2007,15(19):2144-2147.

[5]朱大興,周清華,王艷萍,等.利用定點突變技術構建突變nm23H1和EGFP融合基因[J].中國肺癌雜志,2006,9(2):117.

[6]Liu YB,Gao SL,Chen XP,et al.Expression and significance of heparanase and nm23H1 in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2005,11(9):3392-3397.