高秀瑩，周迎生

(首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院內分泌代謝科，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

糖尿病已成為全球性的公共健康問題，據IDF統(tǒng)計2013年全球糖尿病患者達3.82 億，預計至2035年全球糖尿病患者將增至5.92 億［1］。在我國，糖尿病成為繼腫瘤、心腦血管病之后的第三大嚴重危害人們健康的慢性疾病，2010年我國糖尿病患者已達9240 萬［2］，其中超過90%的患者為2 型糖尿病。2 型糖尿病的發(fā)病機制尚未明確，建立一種既符合人類2 型糖尿病發(fā)病特點，又穩(wěn)定、實用的動物模型在2 型糖尿病研究中起著至關重要的作用。鼠類作為目前應用最廣的糖尿病動物模型，因其體積小、生長周期短、經濟易得、易于實現基因修飾等，較其他種屬有著無可比擬的優(yōu)勢。目前2 型糖尿病鼠類模型主要分為三大類:自發(fā)性2 型糖尿病模型、誘發(fā)性2 型糖尿病模型、轉基因/基因敲除2 型糖尿病模型。本文對近年來國內外較常用的2 型糖尿病鼠類模型構建、主要疾病特征、確立標準及其應用進行概述，為研究者提供參考。

1 2型糖尿病鼠類模型分類

1.1 自發(fā)性2 型糖尿病模型

該模型動物未經過任何有意識的人工處置，多數采用有自發(fā)性糖尿病傾向的近交系純種動物，按照飼養(yǎng)條件喂養(yǎng)，自發(fā)成模，最接近人類疾病的發(fā)病過程。該模型可分為肥胖自發(fā)性2 型糖尿病模型和非肥胖自發(fā)性2 型糖尿病模型，因2 型糖尿病患者多伴肥胖，故以前者應用居多。

1.1.1 肥胖自發(fā)性2 型糖尿病模型

常用的肥胖自發(fā)性糖尿病模型包括單基因遺傳背景的ob/ob 小鼠、db/db 小鼠、Zucker 糖尿病肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty rat，ZDF)和多基因背景的KK/Ay 小鼠、OLETF 大鼠。

ob/ob 小鼠和db/db 小鼠非常接近人類糖尿病特征，它們分別是瘦素基因突變和瘦素受體突變引起。ob/ob 小鼠(C57BL/6J 背景)，斷奶時即開始發(fā)胖，終生食欲旺盛，11 周齡體重可達野生小鼠的2倍［3］;3 ～4 周齡出現高胰島素血癥、胰島素抵抗、輕度高血糖，最近研究表明ob/ob 小鼠11 周齡即可出現糖尿病周圍神經病變［3］。與db/db 小鼠不同的是，該鼠肥胖及胰島素抵抗較重(15 周齡ob/ob 小鼠vs. db/db 小鼠，54.5±2.3g vs. 40.7±1.1 g)，而血糖僅輕度升高，非空腹血糖一般不超過20 mmol/L，且胰島形態(tài)較大(15 周齡ob/ob 小鼠vs.db/db 小鼠，86±76 μm vs. 47±24 μm)［4］。db/db小鼠(C57BL/6J 背景)在2 周齡出現高胰島素血癥，8 周齡血清胰島素水平可達野生小鼠的15 倍;3～4 周齡明顯肥胖，8 周齡體重可達野生小鼠的2倍;4 ～6 周齡血糖開始升高，8 周齡隨機血糖可高達30 mmol/L，空腹16 h 血糖約16 mmol/L，8 周齡病理切片顯示胰島β 面積增加50% ～80%［5，6］，同時伴高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥，4 ～6月血胰島素水平降低，表現為嚴重的胰島素抵抗和胰島素分泌不足，與人類2 型糖尿病發(fā)病進程類似。db/db小鼠不僅有典型的糖尿病臨床表現，也表現出心肌病、周圍神經病變、糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變、傷口愈合遲滯等糖尿病并發(fā)癥。ZDF 大鼠是從出現糖尿病表型的Zucker(fa/fa)大鼠中篩選出來的，存在瘦素受體突變，是典型的高胰島素血癥肥胖模型，伴高甘油三酯和高膽固醇血癥，血游離脂肪酸升高。雄性6 ～8 周齡，雌性9 ～11 周齡時因β 細胞凋亡增加不能代償胰島素抵抗即發(fā)展為糖尿病，非空腹血糖約在20 mmol/L;6 周齡血漿胰島素升高，8 周齡達對照小鼠3 倍，8 周齡后隨著β 細胞功能進行性下降血漿胰島素水平進行性下降［7，8］，14 周齡時出現胰島素缺乏。ZDF 大鼠常用于研究2 型糖尿病中胰島素抵抗和β 細胞功能損傷關系的機制。

KK/Ay 小鼠是KK 小鼠編碼調節(jié)皮毛顏色的Agouti 基因突變而培育的一種自發(fā)性2 型糖尿病模型。研究報道［9，10］KK/Ay 小鼠6 周齡體重即明顯高于對照組，18 周齡雄性小鼠體重最高達(51.21±1.93)g;6 周齡血漿胰島素升高，為對照小鼠的9.7倍并一直維持在較高水平;10 周齡時血糖升高≥13.9 mmol/L，該鼠血糖最高值平均在22.8 mmol/L左右并穩(wěn)定維持于該水平。KK/Ay 小鼠腎臟損害與人類糖尿病腎病非常相似，是目前國際上廣為采用的研究2 型糖尿病腎病早期病變的良好動物模型。OLETF (Otsuka Long Evans Tokushima Fatty)大鼠是日本Otsuka 制藥公司建立的純系，其膽囊收縮素1 受體缺失，飽腹感信號反饋丟失是導致攝食過量和肥胖的原因。早期以肥胖、胰島素抵抗、脂代謝紊亂為主，β 細胞功能與同系正常LETO 大鼠無顯著差異，與KK/Ay 小鼠顯示的重度肥胖不同，它表現為輕度肥胖，15 周齡時體重比對照小鼠增加11.4%［11］，在18 ～25 周齡緩慢進展為糖尿病，特點為自發(fā)性高血糖伴多食、肥胖、胰島素抵抗，高胰島素血癥、高甘油三酯、高膽固醇血癥，并出現蛋白尿，40 周齡后胰島素分泌功能降低，到晚期合并糖尿病腎?。?1］，與人類2 型糖尿病病程極為相似。胰島病理及超微結構顯示20 周齡胰島增生，β 細胞內可見高度擴張肥大的高爾基體和內質網，但β 細胞內成熟的分泌顆粒減少，可見較多空泡［12］，盡管此時胰島素代償性高分泌，但胰島素質量不佳也是其發(fā)展為糖尿病的原因。OLETF 大鼠提供了一種新的不依賴瘦素信號通路的肥胖模型，廣泛應用于2 型糖尿病及糖尿病腎病研究。

1.1.2 非肥胖自發(fā)性2 型糖尿病模型

GK 大鼠(Goto－Kakizaki)是典型的多基因非肥胖自發(fā)性2 型糖尿病模型，特征是體重增長緩慢明顯低于對照組，血糖輕中度升高，以負荷后高血糖為主，空腹血糖可長時間不高或僅輕度升高，隨機血糖在15 ～23 mmol/L 之間且在相當長時間內(18 個月)穩(wěn)定在該水平，伴胰島素抵抗、胰島素分泌受損，血脂輕度升高。初生GK 大鼠由于β 細胞增殖缺陷和異常凋亡導致成年GK 大鼠胰島β 細胞量下降60%，胰島形態(tài)學改變表現為胰島結構紊亂，β細胞細胞核形狀欠規(guī)則，核仁消失，染色質邊集，核周間隙擴張，無明顯線粒體腫脹，呈凋亡早期改變［13］。該鼠從出生到斷乳(3 ～4 周齡)血糖正常，可作為糖尿病前期模型研究，其后隨機血糖升高、糖耐量減低，14 周齡時葡萄糖刺激的胰島素分泌顯著下降，為正常Wistar 大鼠的25% ～50%。該鼠晚期可出現糖尿病各種并發(fā)癥，且不受肥胖、高血壓等其他因素的干擾，一定程度上可模擬臨床2 型糖尿病患者的病理生理改變，故GK 大鼠是研究糖尿病并發(fā)癥(如腎病、視網膜病、周圍神經病變、大血管病變)非常有用的模型，盡管該模型早期β 細胞破壞與2 型糖尿病發(fā)病機制不甚相同。GK 大鼠還常用于研究胰島β 細胞數量與2 型糖尿病發(fā)生的關系。

1.2 誘發(fā)性2 型糖尿病模型

誘發(fā)性2 型糖尿病模型是通過物理、化學等致病因素人工誘發(fā)出具有2 型糖尿病特征的動物模型。制備方法主要包括手術誘導、化學藥物誘導和飲食誘導。其中手術誘導(胰部分切除術)因操作復雜、誘導時間長、無法控制切除后胰島的再生已很少應用。目前國內外最常用的為化學藥物聯合高能量飲食誘導。

1.2.1 單純高脂或高糖飲食誘導的2 型糖尿病模型

單純給實驗動物飼喂高脂高糖飼料，能夠誘發(fā)肥胖、高脂血癥、高胰島素血癥、糖耐量減低等胰島素抵抗的特征。高脂飲食一般選用脂肪供能占總能量的40% ～60%的高脂飼料，動物喂養(yǎng)高脂飼料的起始年齡最好在6 ～8 周齡，此周齡動物生長代謝旺盛能最有效的誘導肥胖。高糖飲食一般選用果糖或蔗糖，以果糖居多，一般選用60% ～65%高果糖飲食或10%的果糖飲水喂養(yǎng)2 ～16 周［14，15］。與葡萄糖不同的是，果糖不能刺激胰島素分泌，但卻能促進肝脂質從頭合成。高果糖攝入可誘導嚙齒類動物出現代謝綜合征的一些組分包括高血壓、胰島素抵抗、糖耐量減低、血脂紊亂［16］，但需較長時間才能誘導肥胖及空腹血糖升高。蔗糖作為食物中果糖的主要來源，作用與果糖類似。

飲食誘導模型常選用的鼠類動物為沙鼠(Psammomys obesus，P．obesus)、C57BL/6J 小鼠及大鼠。沙鼠是重要的飲食誘導的肥胖和2 型糖尿病模型，沙鼠在自然環(huán)境下不發(fā)生肥胖和糖尿病，若給予高能飲食即發(fā)展為中度肥胖和高血糖，與其他鼠類模型不同的是，沙鼠飲食誘導的糖尿病發(fā)病和進展非常迅速，給予高能飼料1 周，沙鼠出現高胰島素血癥，清晨隨機血糖達15mmol/L［17］，胰島β 細胞體積減為原來的1/3，予高能飲食22d 后出現空腹高血糖，β 細胞量降低，4 ～6 周即出現β 細胞量顯著降低，達β 細胞功能衰竭、胰島素分泌缺失的終末期［18］。沙鼠常被用于藥物干預治療2 型糖尿病的模型。C57BL/6J 也是常用的飲食誘導肥胖模型，盡管有報道給予高脂飲食4 周足以誘導胰島素抵抗［19，2］，但由于β 細胞的代償增生，可長期空腹血糖正常，誘導空腹高血糖往往需要較長的誘導時間(＞16 周)。Mizutani 等［21］給予9 周齡雄性C57BL/6J 小鼠高脂飼料(脂肪含量32%，High－fat Diet 32，CLEA Japan)18 周出現糖尿病(空腹血糖10.6±0.6 mmol/L)。另一項研究［22］以脂肪熱量比為45%的高脂飼料(Research Diet D12451)喂養(yǎng)5 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，12 周時空腹血糖較對照組仍無差異。SD (Sprague－Dawley)大鼠較其他品系的大鼠對高脂飼料非常敏感，也常用作飲食誘導的肥胖糖尿病模型，但仍需較長的誘導時間(＞10 周)才能誘導出2 型糖尿病的主要表型特別是空腹高血糖。Wu 等［23］給予雄性SD 大鼠高果糖飼料(果糖含量66%，Teklad)12 周，出現空腹血糖較對照組升高(6.0±0.5 mmol/L vs. 5.4±0.3 mmol/L)、高胰島素血癥、高脂血癥及高血壓，但尚未達糖尿病標準。張貝等［24］以脂肪熱量比為55%高脂飼料喂養(yǎng)8 周齡雄性Wistar 大鼠23 周，出現內臟肥胖、胰島素抵抗、血甘油三酯及游離脂肪酸升高，但實驗結束時空腹血糖仍無差異。

1.2.2 高脂或高糖飲食+STZ 誘導的2 型糖尿病模型

如上所述，由于單純高脂高糖飲食誘導2 型糖尿病耗時較長，限制了其在研究中的應用。目前應用最廣泛的是高熱量飲食+化學藥物誘發(fā)的2 型糖尿病模型。該方法通過高糖高脂飲食誘導動物胰島素抵抗后，再注射低劑量STZ 部分損傷胰島β 細胞，引起血糖升高，模擬2 型糖尿病的發(fā)病過程并大大縮短了建模的周期。該模型特征為胰島素抵抗、中度高血糖、高血脂、血漿胰島素水平多正常［25］?；瘜W藥物常用鏈脲佐菌素(STZ)，STZ 是氨基葡萄糖的亞硝脲衍生物，可以選擇性破壞胰島β 細胞，誘導動物產生糖尿病，β 細胞損傷的程度取決于STZ 的劑量。以往曾采用大鼠單次大劑量腹腔注射STZ (＞60 mg/kg)造模，病理顯示胰島β 細胞大量破壞，發(fā)病機制上更接近1 型糖尿病，現已較少應用。造模常用的動物為大鼠或小鼠，以大鼠為多，且雄性大鼠比雌性大鼠對STZ 更敏感。關于大、小鼠常用的STZ 劑量尚無統(tǒng)一標準，文獻報道不一，大鼠常用35 ～65 mg/kg，小鼠常用100 ～200 mg/kg 腹腔注射［19，26］。

Srinivasan 等［27］以脂肪熱量比為58%的高脂飼料喂養(yǎng)雄性SD 大鼠(160 ～180 g)2 周，然后以STZ(35 mg/kg)腹腔注射，以非空腹血糖≥16.7 mmol/L 診斷糖尿病，模型組表現為肥胖、胰島素抵抗、高血糖(非空腹血糖23.2±0.5 mmol/L)、高血脂、血胰島素正常，并且該模型對2 種降糖藥吡格列酮和格列吡嗪也很敏感，進一步證實了短期高脂喂養(yǎng)聯合低劑量STZ 注射制作2 型糖尿病模型的可行性和適用性。Ti 等［20］以脂肪含量34.5%的高脂飼料(北京華阜康生物科技有限公司)喂養(yǎng)雄性SD 大鼠(120 ～140 g)4 周，其后以STZ(27.5 mg/kg)腹腔注射，1 周后測空腹血糖＞11.1 mmol/L 入選模型組，模型組表現為多食、多飲、多尿，伴肥胖、胰島素抵抗、中度高血糖(空腹血糖15 ～20 mmol/L)、高血脂，并在糖尿病后6 ～12 周出現糖尿病心肌病。Li等［28］采用7 周齡雄性SD 大鼠，予高脂高糖飲食(10%豬油，20%蔗糖，2%膽固醇，1%膽鹽，北京科澳協(xié)力飼料有限公司)喂養(yǎng)8 周后，禁食12 h 以STZ 45 mg/kg 腹腔注射，3 周后測空腹血糖＞16.7 mmol/L 作為建模成功的標準來研究艾塞那肽的藥代動力學。本課題組曾采用4 周齡雄性SD 大鼠以高脂高糖飼料(20%的脂肪，20%蔗糖)喂養(yǎng)4 周后，一次性腹腔注射低劑量STZ 40 mg/kg 建立2 型糖尿病模型，具有肥胖、高血糖、血脂異常、胰島素抵抗等基本特征，免疫組化顯示胰島內胰島素含量下降但仍維持在一定的水平，與人類初發(fā)2 型糖尿病時β 細胞數量下降50%相符合，從而模擬了2 型糖尿病的病理生理過程［29］。

還有一種非肥胖誘發(fā)性2 型糖尿病模型，即STZ－煙酰胺模型，該模型模擬非肥胖的2 型糖尿病患者(多見于亞洲人群)。Masiello 等［30］對10 周齡雄性Wistar 大鼠在應用65 mg/kg STZ 前15 分鐘，先予煙酰胺(230 mg/kg)腹腔注射，煙酰胺能部分保護β 細胞功能，避免STZ 對β 細胞過多的損傷，使動物產生輕度穩(wěn)定的非空腹高血糖(8.6±0.2 mmol/L vs. 6.7±0.2 mmol/L)而沒有血漿胰島素的改變，并保留了40%的胰島素儲備。

1.3 轉基因/基因敲除2 型糖尿病模型

2 型糖尿病被認為是多基因異常疾病，不同組基因分子水平的缺陷可導致該病不同的病理生理改變。目前已開發(fā)出多種轉基因/基因敲除模型，其中基因敲除法多用，實驗動物多為小鼠。主要涉及以下相關基因位點［31］:胰島素抵抗相關的IRS－1(胰島素受體底物－1)、IRS－2、GLUT－4(葡萄糖轉運蛋白－4)，糖脂代謝相關的PPARs(過氧化酶體增殖物激活受體)，以及胰島素分泌相關的GLUT－2、GK(葡萄糖激酶)、IGF－1R(胰島素樣生長因子1 受體)。常見的模型有IRS－2－/－基因敲除小鼠、GK+/－IRS－1+/－雙基因敲除小鼠、IR+/－IRS－1+/－雙基因敲除雜合小鼠等。此外，新開發(fā)的組織特異性的基因敲除模型可分析某一基因在不同組織中的作用，如β 細胞、肝、腦等特異性的胰島素受體基因敲除模型。近幾年出現的hIAPP(人類胰島淀粉樣多肽)轉基因大鼠作為新的2 型糖尿病模型可用于糖尿病發(fā)病機制及降糖藥物研究［32］。

2 2型糖尿病鼠類模型確立的標準

鼠類模型2 型糖尿病的確立通過血糖來診斷，多采用鼠尾采血、血糖儀測定血糖值。首先，鼠類血糖正常值是多少呢?有報道正常大鼠的空腹血糖在5 ～8 mmol/L［33］，還有報道稱高于人的空腹血糖值［34］。實際上，目前國際并無統(tǒng)一的標準，大多文獻均是把對照鼠血糖值等同于正常血糖值。其次，關于糖尿病成模的血糖標準，各文獻報道不一。大多數文獻以空腹血糖值作為標準，空腹血糖標準在7.0 ～16.7 mmol/L 之間均有報道，以空腹血糖11.1 mmol/L 作為標準者居多。這種差異可能由以下兩種原因造成:一方面可能由于種屬差異所致;另一方面，測空腹血糖時禁食的時間不一，禁食6 ～12 h或過夜不等［20，28，35，36］也是造成上述差異的非常重要的原因。除了空腹血糖，亦有文獻［37］以OGTT糖負荷后血糖作為鼠類糖尿病標準，如OLETF 大鼠以OGTT 后血糖峰值＞16.7 mmol/L 且120 min 血糖＞11.1 mmol/L 診斷糖尿病，符合兩者之一診斷為糖耐量減低(IGT)。還有較少文獻［21，27］以隨機血糖≥16.7 mmol/L 作為鼠類糖尿病標準。此外，也有文獻采用人類2 型糖尿病診斷標準(空腹血糖≥7.0 mmol/L 或OGTT 2h 血糖≥11.1 mmol/L 或隨機血糖≥11.1 mmol/L)作為鼠類2 型糖尿病成模標準［38］。關于2 型糖尿病鼠類模型確立的標準仍有待規(guī)范和統(tǒng)一。

3 各種2 型糖尿病鼠類模型優(yōu)缺點及如何選擇

綜上所述，由于2 型糖尿病是多基因與環(huán)境共同作用的復雜疾病，目前尚沒有任何2 型糖尿病模型能夠包括所有的人類疾病特征。理想的2 型糖尿病動物模型應盡可能模擬人類2 型糖尿病的自然病程，在疾病表現、胰島素分泌功能及病理形態(tài)學方面應盡可能貼近人類，并涵蓋胰島素抵抗和胰島β 細胞功能紊亂這兩個最主要的病理特征。以上各種2型糖尿病鼠類模型各有其優(yōu)缺點。

自發(fā)性糖尿病模型的優(yōu)點為:病程發(fā)展特點與人類2 型糖尿病類似，具有同質的遺傳背景，能控制環(huán)境因素，個體差異性較小，是2 型糖尿病病理、病因研究最理想的動物模型。但由于其頻繁的近親繁殖和單基因遺傳與人類有所差異，及來源相對較少，飼養(yǎng)、繁殖條件要求嚴格，加之價格昂貴等因素，國內尚未普及。有些模型如GK 大鼠在國外應用較多，但由于很難獲得，引入我國時間短，國內應用較少。

誘發(fā)性糖尿病模型，與人類肥胖引起的糖尿病發(fā)病機制相似。尤其高熱量飲食+低劑量STZ 造模方法具有實驗周期短、方法簡便、相對可靠穩(wěn)定、造模成本低等優(yōu)點而成為國內最常用的2 型糖尿病建模方法。但這種造模方式也有其缺陷，即動物對誘導劑的反應不盡相同，會導致個體間有一定的差異，并且STZ 對其他組織也有一定的毒性。故應在保證成模率的前提下，把握好STZ 的劑量。需注意的是因采用的動物品系、起始周齡、高熱量飲食中脂肪的構成比及含量、高脂高糖喂養(yǎng)時間、STZ 的劑量等不同，可導致動物成模的時間及成模后穩(wěn)定性存在較大差別。理論上高脂高糖喂養(yǎng)的時間越長，所需STZ 劑量越小，但考慮到后續(xù)試驗周期，也不應過于延長高脂喂養(yǎng)時間。文獻報道高脂高糖喂養(yǎng)多在2 ～8 周之間，以4 周居多，因高脂4 周足夠誘導胰島素抵抗，并保證STZ 的劑量不至于過大。

轉基因/基因敲除糖尿病模型的優(yōu)點為:通過單個基因導入或敲除，能夠得到糖代謝中某個基因作用的關鍵信息，擴充了對糖尿病發(fā)病機制的探索。但是，2 型糖尿病是多基因與環(huán)境共同作用的結果，并非少數基因的作用，且該技術要求高，成本高，周期長，不適于大批量造模，使其應用受限。

總之，目前應用最廣泛的還是誘發(fā)性2 型糖尿病模型，特別是高熱量飲食聯合低劑量STZ 誘導的2 型糖尿病模型。條件許可的情況下，也可選用自發(fā)性糖尿病模型。而轉基因模型目前尚處于探索階段，相信在不遠的將來，轉基因動物模型將為2 型糖尿病研究提供更科學有效的工具。研究者應根據研究目的、模型特點、實驗條件等具體情況，合理選擇不同的模型，這對于深入研究糖尿病的病因、發(fā)病機制及防治是至關重要的。

4 2型糖尿病鼠類模型目前存在問題

目前2 型糖尿病鼠類模型仍存在許多亟待解決的問題，如:仍缺乏系統(tǒng)規(guī)范的標準，包括2 型糖尿病鼠類模型確立的標準，以空腹血糖還是OGTT 糖負荷后血糖為標準?切點是多少?以及病理形態(tài)學、功能或分子水平改變出現的時間段、程度及測量評估標準仍需系統(tǒng)的研究。

5 總結與展望

隨著對糖尿病研究的逐步深入，相應動物模型的發(fā)展勢在必行，并且隨著分子生物學的快速發(fā)展，發(fā)現2 型糖尿病相關的致病基因越來越多。將來應嘗試建立一種協(xié)同多基因和環(huán)境因素的更為完善的2 型糖尿病模型，使其更接近人類的疾病特征，以便為2 型糖尿病的臨床防治提供良好的平臺。

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