張勇法， 楊建英

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471023；2.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南洛陽 471023）

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是利用抗原和抗體間的特異性反應(yīng)，來識(shí)別和測(cè)定作為待測(cè)物的抗體/抗原，既能夠用于樣品的常規(guī)分析，也能夠用于樣品的定性篩選和定量測(cè)定。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便、快速和經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)點(diǎn)，在真菌毒素或獸藥殘留檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。目前常用的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要有放射免疫檢測(cè)技術(shù)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)、電化學(xué)免疫檢測(cè)技術(shù)、基于量子點(diǎn)的熒光免疫檢測(cè)技術(shù)及時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)技術(shù)、抗體微陣列、免疫傳感器和膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)等（Meng和Xi，2011）。本文對(duì)上述免疫檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及其在真菌毒素或獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用作一綜述。

1 放射免疫檢測(cè)技術(shù)

放射免疫檢測(cè)技術(shù) （RIA）的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、精確性好、試劑價(jià)格低廉、樣品用量少。缺點(diǎn)是其放射性對(duì)人體及環(huán)境均有危害、對(duì)儀器設(shè)備要求高、半衰期較短、容易造成污染。周浩等（2012）用RIA法對(duì)蜂蜜中四環(huán)素類抗生素殘留量進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與LC-MS法驗(yàn)證的結(jié)果符合率達(dá)到100%，并與其他族抗生素?zé)o交叉反應(yīng)。閆磊等（2010）采用RIA法對(duì)牛奶中的黃曲霉毒素含量進(jìn)行大批量初步篩選，檢出限（LOD）達(dá)到0.25 μg/kg。Al-Mazeedi等（2010）采集市場(chǎng)上奶制品、雞蛋、動(dòng)物組織等樣品，用RIA法檢測(cè)其四環(huán)素殘留量，并用LC/MS/MS法驗(yàn)證，二者結(jié)果吻合度達(dá)80%～100%。

2 酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)

酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)（ELISA）的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、成本低、可批量檢測(cè)樣品、穩(wěn)定性好、有效期長。但其靈敏度不夠高，只能定性或半定量。Ji等（2011）采用ELISA法監(jiān)測(cè)小麥粉中嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，DON）的含量，最低檢出限為0.02 μg/mL， 平均回收率達(dá)82% ～93%。Liu等（2010）采用間接競爭ELISA法檢測(cè)雞肉和肝臟組織中氯丙嗪的殘留量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。劉百紅等（2008）用建立的直接競爭ELISA法快速檢測(cè)豬肉等動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶殘留，結(jié)果與同類英國RANDOX試劑盒符合率達(dá)到100%。

3 基于量子點(diǎn)的熒光免疫檢測(cè)技術(shù)

基于量子點(diǎn)的熒光免疫檢測(cè)技術(shù)（QIA法）具有靈敏度高、特異性好、操作簡單快捷，便于推廣等優(yōu)點(diǎn)，但其非特異性吸附問題很難解決。李園園等（2012）建立了間接競爭QIA法檢測(cè)花生中黃曲霉毒素B1，其靈敏度為0.023 ng/mL，檢出限為0.001 ng/mL，與傳統(tǒng)有機(jī)染料FITC二抗法相比，靈敏度可提高30倍。楊淑平等（2011）利用QIA法檢測(cè)小麥面粉中DON的含量，其檢出限為0.038 ng/mL，其靈敏度遠(yuǎn)高于已報(bào)道的氣相色譜/電子捕獲檢測(cè)法 （GC/ECD）、高效液相色譜法（HPLC）和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC/MS）。Chen等（2009）建立了QIA法檢測(cè)雞肉中恩諾沙星的殘留量，檢出限為2.5 ng/mL，加標(biāo)回收率為81%～94%，與ELISA法和HPLC法的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性很好。

4 時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)技術(shù)

時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)技術(shù)（TR-FIA）優(yōu)點(diǎn)是操作便捷、靈敏度高、特異性好、無污染、重復(fù)性好，易于自動(dòng)化操作；然而對(duì)測(cè)試環(huán)境要求高、成本也高。但目前仍是最靈敏的微量分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、臨床疾病診斷、食品安全及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。Oku等（2011）為了監(jiān)測(cè)黑牛的發(fā)情周期，采用TR-FIA法檢測(cè)其牛奶和血漿中孕酮濃度，檢出限為1.53 ng/mL，加標(biāo)回收率為86.5%～98.6%，批間與批內(nèi)變異系數(shù)分別為7.51%、5.46%。楊潤琳等（2010）建立了T-2毒素間接競爭TR-FIA法，該方法靈敏度為0.2 pg/L，批間與批內(nèi)變異系數(shù)分別為12.7%和7.5%，加標(biāo)回收率為89.6%，與ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，相關(guān)系數(shù)達(dá)到92.6%。黃飚等（2008）建立了高靈敏度的赭曲霉毒素A的TR-FIA法，分別檢測(cè)了玉米和大麥等樣品中赭曲霉毒素A的含量，其靈敏度達(dá)到0.02 μg/L，平均回收率為95.8%，批間與批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.6%和5.2%。

5 化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)

化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)（CLIA）優(yōu)點(diǎn)是特異性好、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、無污染、有效期長、便于自動(dòng)化操作。但對(duì)操作時(shí)間要求苛刻，否則工作曲線會(huì)發(fā)生漂移。主要用于臨床分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)和藥物及食品檢測(cè)領(lǐng)域。Fang等（2011）建立了CLIA法，用來測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中殘留的黃曲霉毒素Bl，檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.01 ng/g，加標(biāo)回收率為79.8%～115.4%，批間和批內(nèi)變異系數(shù)分別小于10.0%和12.2%，與商品化的ELISA試劑盒驗(yàn)證結(jié)果相比，二者相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9098。張慧麗等（2011）用CLIA法快速檢測(cè)牛奶中恩諾沙星的殘留量，其檢出限為239.9 pg/mL，加標(biāo)回收率為99.0%～101.4%，批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于15%。邱云青等（2010）建立的快速靈敏CLIA法檢測(cè)玉米粉中赭曲霉毒素的殘留量，檢出限為0.02 ng/mL，加標(biāo)回收率為83.6%～105.8%。

6 電化學(xué)免疫檢測(cè)技術(shù)

電化學(xué)免疫檢測(cè)技術(shù)（ECLIA）優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作便捷、安全可靠、適合大規(guī)模生產(chǎn)，尤其適用于微量樣品的檢測(cè)，但特異性較差。李利軍等（2009）建立了一種ECLIA法用于測(cè)定尿液中鹽酸氯丙嗪含量，其檢出限為6.0×10-7mol/L，加標(biāo)回收率為97% ～107%。Liang等（2008）建立了一種ECLIA法用于檢測(cè)睪酮含量，檢出限為0.1 ng/mL。藍(lán)蘇梅等（2009）建立了一種ECLIA法測(cè)定膠囊中鹽酸克林霉素含量，檢出限為1.0×10-7mol/L，加標(biāo)回收率為93%～102%。

7 抗體芯片檢測(cè)技術(shù)

抗體芯片也稱免疫芯片，其優(yōu)點(diǎn)操作簡單快捷、生產(chǎn)成本低、信息量大、用途廣泛、自動(dòng)化程度高等，缺點(diǎn)是單克隆抗體不易獲得，被檢標(biāo)本中的抗原或抗體含量較低難進(jìn)行體外擴(kuò)增或濃縮，芯片的封裝和儲(chǔ)存條件苛刻，對(duì)于分子量和濃度范圍極廣的待檢物難于定量分析等。Wang等（2012）將真菌毒素（如黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素、玉米烯酮）與牛血清白蛋白偶聯(lián)，建立間接競爭抗體芯片檢測(cè)技術(shù)，加標(biāo)回收率為80%～120%，其最低檢測(cè)濃度分別是 0.01、0.24、15.45、15.39、0.05、0.01 ng/mL。Zhong等（2010）通過抗體芯片檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)雞肉組織中克倫特羅的殘留量，與間接ELISA方法相比加標(biāo)回收率升高了14%，達(dá)到90%。

8 免疫傳感器

免疫傳感器優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高、樣品需要量少、樣品無需處理、實(shí)時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)、操作簡單快捷、應(yīng)用范圍廣。缺點(diǎn)是成本高、非特異性強(qiáng)、對(duì)溫度、樣品組成等敏感，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在食品安全、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、真菌毒素或獸藥殘留檢測(cè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。Li等（2012）報(bào)道利用表面等離子體共振傳感器法 （SPR）檢測(cè)真菌毒素，其中DON的檢出限達(dá)0.5 ng/g，HT-2毒素在早餐谷類、小麥和嬰兒食品中的檢出限分別達(dá)到 25、26、25 μg/kg。Dumont等（2006）用SPR檢測(cè)了蝦肉組織中4種抗生素：甲砜霉素（硫霉素）、氟苯尼考（氟洛芬，氟甲砜霉素）、氟苯尼考胺和氯霉素的殘留，最低檢測(cè)濃 度 分 別 是 0.1、0.2、250、0.5 ppb。 Haughey 等（2001）報(bào)道了利用免疫傳感器法檢測(cè)牛尿中克倫特羅的殘留量，操作時(shí)間僅7 min，檢出限為0.27 ng/mL，回收率在95%左右，批間和批內(nèi)變異系數(shù)分別為9.2%～12.7%和4.7%～7.6%。

9 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法（GICA）具有操作簡單快速、設(shè)備簡單、無污染、肉眼直接觀察結(jié)果、便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)，不過只能用于定性（僅限陰性和陽性之分）及半定量分析（僅能把待測(cè)物含量確定于某一范圍）。Xu等（2010）通過膠體金免疫試紙條法快速檢測(cè)小麥和玉米中DON的殘留量，檢出限為50 ng/mL，并用氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）法驗(yàn)證，二者具有很好的相關(guān)性。Zhu等（2008）利用膠體金免疫試紙條法10 min內(nèi)檢測(cè)了12種氟喹諾酮類藥物，其中2種藥物的檢出限為25 ng/mL，其余10種為50 ng/mL。陳義強(qiáng)等（2009）通過膠體金免疫層析法對(duì)樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速篩選，僅10 min可完成操作，并與傳統(tǒng)的ELISA法和HPLC法結(jié)果對(duì)比，三者的測(cè)定結(jié)果完全相符。

10 小結(jié)

真菌毒素和獸藥殘留與食品安全息息相關(guān)，研究其相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)顯得尤為重要。免疫檢測(cè)技術(shù)的研究是當(dāng)前檢測(cè)與診斷科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域里最為活躍的分支，因此，本文分別分析了多種免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及使用情況，為尋找準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)、高效的檢測(cè)方法，保證食品安全，確保人民健康奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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