殷安國，匡德宣，李曉飛，張媛，孫曉梅，夏雪山，代解杰

(1.昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明 650500;2.中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118;)

樹鼩(Tupaia belangeri，tree shrew)，一種廣泛存在于南亞、東南亞和中國西南地區(qū)［1］的動物，現在被歸為攀鼩目.最近幾十年來，因為作為一種實驗動物，擁有著多種獨特的特質(例如，體積小，腦與身體的比重大，生殖周期短，飼養(yǎng)花費少，最重要的是，被認為與靈長類關系非常近)，樹鼩已經被提議在生物醫(yī)學研究和藥物安全測試方面［2］可替換靈長類動物成為有效的動物模型。

當今，有許多研究人員嘗試用樹鼩來構建動物模型，這樣能更好的研究丙型肝病毒(HCV)［3］和乙型肝炎病毒(HBV)［4］感染、近視、競爭壓力和抑郁癥。

1 肝炎病毒

1.1 甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV)

在甲型肝炎病毒方面，詹美云等［5］讓樹鼩口服甲肝病毒陽性病人新鮮大便濾液，并在隨后的時間里，可在樹鼩糞便里檢測出甲肝抗原，此抗原可被甲肝恢復期病人血清中和，且感染2～16 周的樹鼩血清中可檢測出甲肝抗體，抗體陽轉率78%，從電鏡中觀察到感染樹鼩糞便中的病毒顆粒。實驗結果初步的說明了樹鼩可能成為甲肝病毒的敏感動物，但是否引起樹鼩肝病變尚無明確研究。

1.2 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)

我國是HBV 感染高發(fā)區(qū)，在我國的感染者約1.2 億以上，在HBV 感染原代樹鼩肝細胞的實驗中，Walter 等［6］在HBV 感染的原代樹鼩肝細胞中檢測到病毒的DNA 和RNA 合成，在培養(yǎng)上清液中檢測到分泌的HBsAg 和HBeAg。他們的發(fā)現證明樹鼩肝細胞本身適合靈長類動物HBV 復制。在HBV體內感染樹鼩實驗中，Walter［6］等在感染4 日齡幼樹鼩時，血清學檢測發(fā)現幼齡樹鼩感染類似于人類急性自限性乙型肝炎，認為在樹鼩體內感染時病毒的復制和基因表達水平可能較低。楊芳等［7］用新生樹鼩感染人HBV，證實病毒能在樹鼩體內長期存在并穩(wěn)定復制。龐其方等［8］用HBV 陽性人血清肌注感染樹鼩，結果發(fā)現樹鼩可能是繼黑猩猩和長臂猿之后對HBV 敏感的動物。蘇建家等［9］用人HBV接種53 只樹鼩，發(fā)現45 只樹鼩(84.9%)的血清和肝細胞有人HBV 標記物，利用血清學、免疫組化、分子雜交及電鏡檢查等技術，在接種了人HBV 的樹鼩血中可查見HBsAg 及Dane 顆粒，在肝細胞也檢測出HBsAg、HbcAg 和HBV DNA，表明樹鼩可作為人HBV 感染模型。Huan 等［10］繪制了一幅高質量的樹鼩肝細胞基因表達圖譜，經過深入分析后，發(fā)現肝臟膽汁酸轉運體(NTCP，?；悄懰徕c共轉運多肽)會與乙肝病毒包膜蛋白的關鍵受體結合域發(fā)生特異性相互作用，隨后進行了一些系列細胞實驗，證明肝臟膽汁酸轉運蛋白的確是HBV 病毒感染所需的細胞受體。

盡管有上述HBV 實驗感染樹鼩感染率較低，但隨著樹鼩肝細胞HBV 受體的發(fā)現，及受體進一步的深化研究，樹鼩用來做感染HBV 的動物模型的可靠性和實用性也會得到提高。

1.3 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)

在2005 年，趙西平等［11］證實了在樹鼩的原代肝細胞中HCV 病毒確實可以復制，研究人員用從HCV 陽性病人身上獲得血清或血漿感染樹鼩原代肝細胞，用RT-PCR 方法檢測到了負鏈RNA，這確認了樹鼩被感染和病毒的復制，HCV RNA 可以一直檢測到接種后第14 天。組裝好的病毒可以不被RNA酶降解，且具有感染其他健康樹鼩的能力。謝志春等［12］比較了正常樹鼩和經750cGy 的X 射線全身輻照樹鼩的感染HCV 狀況，發(fā)現輻照后的樹鼩對HCV 表現出了更高的易感性且病毒持續(xù)時間明顯增長。提示輻照等方式是降低動物免疫能力，促進感染慢性化的一種方法。2010 年，Amako 等［13］報道了被HCV 全長cDNA 感染后長達3 年的樹鼩跟蹤研究，在急性感染期實驗動物顯示出了輕微的炎癥和病毒血癥，隨后發(fā)展為脂肪肝、肝硬化、肝腫瘤的發(fā)生。從這些已被感染的樹鼩中抽取的血清通過靜脈注射到健康樹鼩后，會導致健康樹鼩發(fā)生急性感染，這表明HCV 病毒可以在樹鼩體內有效的復制且復制后的病毒具有感染其他樹鼩的能力。

綜上所述，樹鼩可急性感染HCV，同時原代肝細胞分離培養(yǎng)后可感染HCV，但是HCV 感染樹鼩后病毒的復制及表達水平不高，故慢性HCV 丙肝模型有待進一步探索。另外，目前我國的樹鼩多為野生型，ALT 基礎水平偏高，許多學者對所得的感染結果提出質疑。在樹鼩體內外進行丙肝機制的研究，為丙型肝炎的發(fā)病機制、預防治療及新藥的研發(fā)奠定了基礎?？梢钥吹剑S著研究的深入，樹鼩有望成為HCV 感染的理想動物模型。

1.4 丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus，HDV)

HDV 是一種缺陷病毒，需HBV 輔助才能進行復制，所以HDV 感染者首先要有HBV 感染。丁明權等［14］用HDV/HBV 陽性人血清經同時和重疊感染方式接種于成年樹鼩后，定期留取感染樹鼩血清及肝組織，檢測血清中HBsAg、HDAg、抗-HD、HBV DNA 及HDV RNA，研究發(fā)現成年樹鼩對人HBV 易感，HBsAg 陽性率為75%，部分樹鼩經分子雜交證實其血清及肝內有HBV DNA 存在。在感染HBV的基礎上，經分子雜交檢測，其血清及肝內亦有HDV RNA 存在，部分樹鼩血清HDAg、抗-HD 陽性。肝組織病理檢查顯示，肝細胞有明顯的變性壞死及炎細胞浸潤，較單純HBV 感染時重。李奇芬等［15］觀察到的結果也與上述實驗結果相同，血清學表現及肝組織病變與在黑猩猩實驗感染HDV 中觀察到的情況十分相似，提示成年樹鼩可用于丁型肝炎動物模型的研究。

2 腸道病毒EV71(Human enterovirus 71，EV71)

手足口病多發(fā)于5 歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，甚至可引起中樞神經系統(tǒng)疾病和相關心肺功能衰竭等癥狀，常見的引起手足口病的病毒為腸道病毒EV71。王文廣等［16］對3 月齡的樹鼩采用灌胃、滴鼻、尾靜脈注射3 種方式進行感染，結果發(fā)現，實驗組樹鼩在第4 天前后出現體溫升高，白細胞、淋巴細胞水平也有類似變化;病毒載量在3 種攻毒方式的實驗組樹鼩中均可被檢測到，峰值出現在第10 天前后，灌胃途徑尤為明顯，血清的最大中和抗體效價為1∶16。在第2 周左右，部分實驗組樹鼩出現急性松弛性癱瘓，解剖后發(fā)現伴有尿潴留癥狀;通過組織病理學檢查可以發(fā)現發(fā)病樹鼩在腦、肺、腸、脾臟、腎等部位發(fā)生病理變化。該實驗表明EV71 病毒通過灌胃、滴鼻和靜脈注射3 種方式均可感染中緬樹鼩，這為以后研究EV71 感染樹鼩的致病機理、建立手足口病動物模型奠定了基礎，但EV71 是否對各年齡段的樹鼩均可感染還有待進一步驗證。

3 單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)

單純皰疹病毒(HSV)屬皰疹病毒科單純皰疹病毒屬。HSV 可分為HSV-1 和HSV-2，HSV-1 主要引起腰以上感染;HSV-2 主要則與腰以下感染有關。Darai 等［17］采用靜脈注射、腹腔注射、皮下注射這3種方式給1 月齡(28～45d)和成年樹鼩(150d)注射HSV 1 或HSV 2 型病毒，在感染后第2 天幼年樹鼩即出現臨床癥狀，隨后死亡。從肝臟和脾臟中可獲得高滴度的HSV 病毒。病理組織學檢查發(fā)現肝臟部分區(qū)域壞死等嚴重的肝臟變化，形態(tài)學上變化為出現皰疹肝炎，其他臟器亦出現病理變化，如腦炎和脾臟中的纖維化。這些結果顯示出HSV 1 和HSV 2在幼年樹鼩身上的高致病性。相反的，成年樹鼩沒有發(fā)現臨床癥狀和HSV 病毒。

4 流感病毒(Influenza virus)

流感是最常見的多發(fā)病之一，但是目前尚無較為合適的動物模型。雪貂雖敏感，但不易獲得。小鼠必須連續(xù)傳代，才可適應。而幼年或初生者的金黃倉鼠、大鼠、豬等較敏感。至于猴、豚鼠、狗等接種后多為不顯性感染。朱宇同等［18］用3 種流感病毒對樹鼩由鼻腔滴入接種，實驗發(fā)現接種后的三天中，新A1型或A3型，樹鼩的平均肛溫與接種前相比有明顯的增加。C 型流感病毒感染的樹鼩則無體溫升高。B 型流感病毒感染后，體溫略有升高，但半數個體無發(fā)熱反應。樹鼩在感染A 型或B 型后，可從鼻咽液分離出流感病毒，持續(xù)排毒長者可達17 天，接種C 型流感病毒的樹鼩未能從鼻咽液中分離出病毒，但血清抗體轉陽，可能為隱形感染排毒甚少。接種前樹鼩血液均未檢出流感抗體，接種后絕大多數樹鼩產生抗體，2～3 周為高峰，常規(guī)法滴度達1∶60～1∶1280 左右。2 只樹鼩置于隔壁僅有一小窗空氣相通，發(fā)現亦能發(fā)生接觸交叉感染。用云南樹鼩感染流感病毒A3 型、新A1 型或B 型均獲成功，出現規(guī)律排毒且有抗體增長，多數有上呼吸道感染癥狀，體溫曲線不規(guī)律，可通過接觸感染，因此樹鼩可能是用于研究流感病毒的較好動物模型，值得我們進一步深入研究并不斷完善此模型。

5 輪狀病毒(Rotavirus)

輪狀病毒是秋季嬰兒胃腸炎的主要病原。萬新邦等［19］用含有輪狀病毒的嬰兒腹瀉糞液，經處理后分為不同濃度的上清液對實驗樹鼩進行灌胃感染，最早于第2 天排稀糞，全部發(fā)病，普遍表現為呆滯蜷縮，體毛蓬松，食欲減退，體重減輕。個別樹鼩腹瀉頻繁，嚴重脫水后死亡，病理組織學檢查發(fā)現死亡樹鼩的十二指腸、空腸、回腸和結腸腸腔內均有腸上皮細胞和腸絨毛脫落，有較多淋巴細胞、漿細胞和巨噬細胞浸潤，回腸淋巴小節(jié)增生。通過電鏡檢查均在樹鼩的糞液中找到輪狀病毒，用發(fā)病樹鼩的糞液感染第2 代及第3 代樹鼩，亦可在發(fā)病期間檢測到全部和2/3 的陽性結果。血清抗人輪狀病毒抗體在病程中有4 倍以上增長。這些結果表明成年樹鼩可能是對人輪狀病毒的易感動物。

6 基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)

基孔肯雅熱是由基孔肯雅病毒引起的一種人獸共患病，主要流行于非洲和東南亞地區(qū)。張海林等［20］用從蝙蝠和基孔肯亞熱陽性患者體內分離到的病毒以及國外原型株ROSS 這3 株基孔肯雅病毒感染樹鼩后，動物出現飲食減少，活動差，3 株病毒感染的樹鼩均能產生病毒血癥，12 只樹鼩中有11只產生血凝抑制(HI)抗體、中和(NT)抗體、補體結合(CF)抗體，血凝抑制抗與中和抗體二者相關性非常顯著(P＜0.01)。且能在其腦、肺、肝、脾和腎等組織中檢測到病毒，病理檢測顯示這些內臟組織呈炎性改變和出血傾向，表明基孔肯亞病毒能侵襲樹鼩各主要臟器，認為樹鼩對基孔肯亞病毒敏感。樹鼩感染基孔肯亞病毒后的病毒血癥滴度足以感染蚊蟲，在該病毒的保存和傳播中可能具有一定流行病學意義，有必要進行深入研究。

7 腺病毒(Adenovirus，ADV)

陳元鼎等［21］運用聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)從90份云南樹鼩大便中檢出12 份含腺病毒的糞便樣品，用電鏡(EM)觀察到樣品中含有典型腺病毒顆粒，陽性率為13%，這進一步證實了PAGE 的結果。病毒DNA 電泳圖型類似于腸道腺病毒，但血凝實驗發(fā)現這些病毒具有低滴度的凝聚人O 型、B 型紅細胞的作用，這種樹鼩腺病毒的血清學關系與人類腺病毒之間的關系以及能否將人類腺病毒運用到樹鼩身上建立一種成熟的動物模型尚待進一步研究。

8 問題與展望

大小鼠在HBV 和HCV 方面亦有很深的研究，如蔣黎等［22］運用宮內注射人胎肝細胞形成免疫耐受的方法建立人鼠嵌合肝HBV 感染模型及Michael等［23］采用給缺陷小鼠注射肝祖/干細胞的方法建立人源化小鼠HCV 感染模型，但人鼠嵌合肝和人源化小鼠操作繁瑣，周期較長，死亡率高，造價昂貴，故不利于實驗的進行。而近年來，樹鼩因它在生理、生化及解剖學等生物學特性方面與人類有著相似之處，正日益受到國內外的關注，成為一種新型實驗動物，但事實上我們仍缺少針對樹鼩的特異性的專有檢測試劑及成品試劑盒，用人類或其他物種的檢測試劑盒來檢測樹鼩并不能真實且準確的反映出實際的結果，所以要求獲得樹鼩大量的且系統(tǒng)的基因組學、蛋白質組學、神經系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等相關方面信息。一種實驗動物的使用要求動物的遺傳背景清晰，而實現實驗動物的標準化和規(guī)?；蠼游锓忾]群和品系，這也是現階段亟需解決的問題。隨著樹鼩全基因組序列的獲得及世界專家的重視，相信上述問題最終會一一被解決，樹鼩將作為新型實驗動物被研究人員廣泛的認同和接受及使用。樹鼩在人類疾病動物模型方面的優(yōu)勢對于探究人類疾病機理、消除人類疾病痛苦、提高人類生活水平方面將發(fā)揮著重大的作用。

［ 1］彭燕章，葉智彰，鄒如金，等.樹鼩生物學［M］.云南科技出版社，1991，1－2.

［ 2］Cao J，Yang EB.，Su JJ，et al.The tree shrews:adjuncts and alternatives to primates as models for biomedical research［J］.Med Primatol，2003，32:123 –130.

［ 3］Zhao，XP，Tang ZY，Bettina K，et al.Primary hepatocytes of Tupaia belangeri as a potential model for hepatitis C virus infection［J］.Clin Invest，2002，109:221 –232.

［ 4］Rui QY，Jian JS，Ding RH，et al.Human hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma.Ⅱ.Experimental infection of tree shrews with hepatitis B virus［J］.Cancer Res Clin Oncol，1996，122:283 –288.

［ 5］詹美云，劉崇相，李成明，等.甲型肝炎病毒感染樹鼩的初步研究［J］.中國醫(yī)學科學院學報，1981，3(3):148－152.

［ 6］Walter E，Keist R，Niederost B，et al.Hepatitis B virus infection of Tupaia hepatocytes in vitro and in vivo［J］.Hepatology.1996，24:1－5.

［ 7］楊芳，曹驥，張晶晶，等.新生期樹鼩接種人乙型肝炎病毒的長期實驗觀察［J］.中華肝臟病雜志，2009，17(8):580－584.

［ 8］龐其方，萬新邦，胥愛源，等.乙型肝炎病毒(HBV)感染樹鼩的實驗研究［J］.醫(yī)學研究通訊，1981，9:9－11.

［ 9］蘇建家，嚴瑞琪，甘有全，等.人乙型肝炎病毒感染成年樹鼩的研究［J］.上海實驗動物科學，1986，6(4):193－198.

［10］Yuan Y，Zhong GC，Xu GW，et al.Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus［J］.eLife，2012;1:e00049.

［11］趙西平，田展飛，陳義春，等.丙型肝炎病毒體外可感染樹鼩肝細胞［J］.中華肝臟病雜志，2005，13(11):805－807.

［12］謝志春，高志偉，蘇寒潔，等.樹鼩對丙型肝炎病毒的易感性研究［J］.廣西醫(yī)科大學學報，2000，17:347－350.

［13］Amako Y，Tsukiyama-Kohara K，Katsume A，et al.Pathogenesis of hepatitis C virus infection in Tupaia belangeri［J］.J Virol，2010，12:303－311.

［14］丁明權，李奇芬，吳純清，等.成年樹嗣實驗感染丁型肝炎病毒的初步研究［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，1995，9:138－141.

［15］李奇芬，丁明權，王洪，等.樹鼩感染丁型肝炎病毒的實驗研究［J］.中華醫(yī)學雜志，1995，75:611－613.

［16］王文廣，黃曉燕，徐娟，等.EV71 可感染幼齡中緬樹鼩［J］.動物學研究，2012，33(1):7－13.

［17］Darai G，Schwaier A，Komitowski D.Experimental Infection of Tupaia belangeri(Tree Shrews)with herpes simplex virus types 1 and 2［J］.J Infec Dis，1978，137(3):221－226.

［18］朱宇同，王維祥，曾子安，等.流感病毒感染成年樹鼩的研究［J］.上海實驗動物科學，1986，6(1):20－23.

［19］萬新邦，劉璣昌，胥愛源，等.用人輪狀病毒感染成年樹晌的實驗研究［J］.中華醫(yī)學雜志，1982，62:461－465.

［20］張海林，米竹青，施華芳，等.樹鼩實驗感染基孔肯雅病毒的研究［J］.病毒學報，1991，7(2):137－141.

［21］陳元鼎，戴國珍，李軍，等.樹鼩大便中腺病毒的實驗研究［J］.中國人獸共患病雜志，1987，3(3):2－5.

［22］蔣黎.人鼠嵌合肝動物模型及其感染HBV 的初步研究［D］.第三軍醫(yī)大學，2004.

［23］Washbum ML，Bility MT，Zhang LG，et al.A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection，immune response，and liver disease［J］.Gastroenterology，2012，140(4):1334－1344.