蔡文杰，王 艷，隨 力，王銘潔

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)教研室，上海 200093；2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 200032）

硫化氫（H2S）是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的氣體信號(hào)分子［1］，我們?cè)鴪?bào)道了 H2S具有促血管新生的能力［2－3］，而血管新生可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散。結(jié)腸癌細(xì)胞能表達(dá)合成H2S的兩個(gè)酶：胱硫醚-β-合酶 （CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶 （CSE），其中CSE含量遠(yuǎn)大于CBS的含量［4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)干擾內(nèi)源性H2S的生成來(lái)探討其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HCT116細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，6周齡BALB／c裸鼠由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，BrdU參入試劑盒購(gòu)自Roche公司。

1.2 shRNA慢病毒的制備 針對(duì)CSE基因設(shè)計(jì)shRNA序列，克隆到 pGLVH1／GFP載體，與 pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，3 d后收集培養(yǎng)液，超速離心后得到慢病毒。

1.3 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 分為干擾組和對(duì)照組，分別用CSE干擾慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒感染細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)株。干擾組細(xì)胞接種于鼠左肋部皮下，對(duì)照組細(xì)胞則接種于同一鼠的右肋部皮下，接種量都為2×106個(gè)細(xì)胞。腫瘤體積按V＝1／2長(zhǎng)徑×短徑2計(jì)算。

1.4 細(xì)胞增殖 細(xì)胞換無(wú)血清后給予不同濃度的NaHS處理24 h，用10μmol·L－1BrdU孵育2 h，再分別用抗BrdU抗體、HRP標(biāo)記的二抗處理，TMB顯色后在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，用Systat 12軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間比較用單因素方差分析，兩組比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CSE干擾慢病毒構(gòu)建成功 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)顯示，針對(duì)CSE基因895位點(diǎn)的shRNA序列（5′-GCCCAGTTCCTGGAATCTAATTTCAAGAGAATTAGATTCCAGGAACTGGGCTT-3′）能抑制 CSE基因的表達(dá)，抑制率達(dá)到（87.8±3.9）%。

2.2 干擾CSE表達(dá)抑制移植瘤的生長(zhǎng) HCT116細(xì)胞接種裸鼠皮下10 d后，處死并取出瘤組織，干擾組與對(duì)照組腫瘤大小分別為：（0.28±0.05）cm3與（0.63±0.14）cm3，腫瘤重量分別為：（0.25±0.05）g與（0.59±0.11）g。兩組比較差異均有顯著性（P＜0.05，n＝8）。

2.3 H2S促進(jìn)體外細(xì)胞增殖 外源性給予50μmol·L－1NaHS后細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比提高了（20.5±4.8）%（P＜0.05），給予 200μmol·L－1NaHS后促進(jìn)增殖達(dá)（28.6±6.2）%（P＜0.01），差異具有顯著性。抑制內(nèi)源性 CSE表達(dá)后，與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖略有下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n＝6）。

3 討論

結(jié)腸癌細(xì)胞中CSE含量遠(yuǎn)大于CBS的含量［4］，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)CSE的shRNA慢病毒，通過(guò)降低CSE的表達(dá)來(lái)減少了內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生。體外實(shí)驗(yàn)中，外源性給予H2S能促進(jìn)細(xì)胞增殖，但干擾內(nèi)源性生成后細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化，可能是因?yàn)樵诩?xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中內(nèi)源性產(chǎn)生的H2S濃度低且易擴(kuò)散，導(dǎo)致對(duì)照組與干擾組間無(wú)明顯差異。而在裸鼠移植瘤中，干擾組明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，這很可能是因?yàn)楦蓴_組局部微環(huán)境的H2S濃度比較低，抑制了血管新生，所以腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。Szabo等［5］最近通過(guò)干擾CBS來(lái)抑制內(nèi)源性H2S的生成，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)新血管的生成明顯減少，這證實(shí)了我們的猜想，同時(shí)也提示了CBS和CSE這兩個(gè)酶對(duì)結(jié)腸腫瘤的生長(zhǎng)都很重要。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 蔡文杰，琚立華，朱依純.硫化氫的治療性應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（7）：854－6.

［1］ CaiW J，Ju L H，Zhu Y C.Research progress on hydrogen sulfide’s potential therapeutic use［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（7）：854－6.

［2］ CaiW J，Wang M J，Moore P K，et al.The novel proangiogenic effect of hydrogen sulfide is dependent on Akt phosphorylation［J］.Cardiovasc Res，2007，76（1）：29－40.

［3］ K?hn C，Dubrovska G，Huang Y，et al.Hydrogen sulfide：potent regulator of vascular tone and stimulator of angiogenesis［J］.Int J Biomed Sci，2012，8（2）：81－6.

［4］ CaiW J，Wang M J，Ju L H，et al.Hydrogen sulfide induces human colon cancer cell proliferation：role of Akt，ERK and p21［J］.Cell Biol Int，2010，34（6）：565－72.

［5］ Szabo C，Coletta C，Chao C，et al.Tumor-derived hydrogen sulfide，produced by cystathionine-β-synthase，stimulates bioenergetics，cell proliferation，and angiogenesis in colon cancer［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（30）：12474－9.