周 雯，關 婷

1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院婦產科，廣州 510010

2廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510010

宮頸鱗狀細胞癌化療前后小分子RNA-96的表達變化及其與化療敏感性的關系

周 雯1，2，關 婷1

1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院婦產科，廣州 510010

2廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510010

目的探討新輔助化療對宮頸鱗狀細胞癌小分子RNA-96(miR-96)表達的影響及其與化療療效、敏感性及臨床病理特征之間的關系。方法采用莖環(huán)實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR)檢測28例 (Ⅰb2期～Ⅱa期)宮頸鱗狀細胞癌患者新輔助化療前、后癌組織中miR-96的表達，分析miR-96表達變化與新輔助化療的療效、敏感性及其與臨床病理特征的關系。結果RT-PCR檢測miR-96表達的敏感性和特異性良好;新輔助化療前宮頸癌組織中miR-96的相對表達量是化療后宮頸癌組織中的 (5．330±5．069)倍，差異具有統(tǒng)計學有意義 (P=0．000)?；熐昂髆iR-96的表達變化：中、低分化者 (2．345±1．153) 低于高分化者 (9．941±5．359)(P=0．000); 間質浸潤深度＜1/2間質者 (8．236±5．399) 高于≥1/2間質者 (1．978±1．030) (P=0．000);有淋巴結轉移者 (1．848±0．959) 明顯低于無淋巴結轉移者(7．942±5．348)(P=0．000);而年齡≤45歲、＞45歲，臨床分期為Ⅰb2期、Ⅱa期者化療前后miR-96的表達變化差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0．05)。結論新輔助化療能有效降低宮頸鱗狀細胞癌組織中miR-96的表達水平，因此測定化療前宮頸癌組織中miR-96的表達水平對新輔助化療療效及敏感性預測具有一定參考價值。

宮頸鱗狀細胞癌;小分子RNA-96;新輔助化療;化療敏感性

Acta Acad Med Sin，2014，36(2)：140-144

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，占女性生殖道惡性腫瘤首位。以往認為宮頸癌屬化療不敏感腫瘤，因此手術和放療為宮頸癌的主要治療方法，直至1984年Friedlander等［1］指出宮頸癌是化療敏感性腫瘤，并首次提出新輔助化療 (neoadjuvant chemotherapy，NACT)的概念，從此NACT作為宮頸癌的治療手段逐漸受到重視。有報道顯示，NACT后再手術的患者盆腔淋巴結轉移、宮旁組織侵襲率和血管間隙受侵率等預后不良相關病理因素顯著減少［2］。但是，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)公認的能夠準確預測NACT療效和敏感性的工具。小分子RNA是一種內源性、大小約22個核苷酸、不能編碼蛋白質的單鏈小分子RNA，可以通過特異性靶基因沉默來調控基因表達，發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用，參與人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［3］。同時，小分子RNA在腫瘤疾病預后預測及放化療敏感性預測和腫瘤干預治療方面顯示出強大優(yōu)勢。研究顯示抗腫瘤藥物可改變小分子RNA的表達［4-6］，小分子RNA表達的改變能影響化療藥物的敏感性［7-9］。小分子RNA-96(microRNA-96，miR-96) 位于人類染色體7q32．2，研究顯示miR-96在多種人類惡性腫瘤中表達異常，并參與廣泛的細胞調節(jié)過程，包括調節(jié)細胞增殖［10-13］、衰老［14］、細胞遷移［15-16］和轉移［10］，另外，研究顯示miR-96能改變腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［17］。本研究應用實時熒光定量PCR的方法，檢測miR-96在新輔助化療前、后宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達情況，旨在進一步探討其對新輔助化療的療效、敏感性及其與臨床病理特征間的關系。

資料和方法

資料 選取2011年5月至2012年12月廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院婦產科28例行新輔助化療+宮頸癌根治術的宮頸鱗狀細胞癌患者新輔助化療前、后的癌組織標本，所有標本經病理診斷證實?；颊吣挲g32～64歲，平均 (48．8±8．4) 歲，≤45歲12例，＞45歲16例;手術分期：按2009年國際婦產科聯(lián)盟的分期標準，Ⅰb2期15例，Ⅱa期13例;病理分化程度：高分化11例，中、低分化17例;有盆腔淋巴結轉移者12例，無盆腔淋巴結轉移者16例;間質浸潤深度＜1/2間質13例，≥1/2間質15例。

NACT方法28例患者均采取全身靜脈滴注化療，采用紫杉醇聯(lián)合卡鉑3周方案 (卡鉑AUC 5+紫杉醇175 mg/m2)化療2個療程，間隔療程為3周?；熀蟊O(jiān)測血常規(guī)、肝腎功能，必要時給予對癥治療。患者完成2個化療后3周行婦科檢查及影像學檢查，判斷腫瘤消退情況，并行相關手術前化驗檢查，無禁忌證者行廣泛子宮切除加盆腔淋巴結切除術，年齡≤45歲者保留一側卵巢，術后病理回報盆腔淋巴結、卵巢及宮旁組織有轉移的患者追加盆腔外照射，術后病理陰道斷端距病灶1．5 cm以內者追加后裝放療;年齡＞45歲的患者同時行雙側附件切除，術中剖視子宮，根據(jù)術后病理結果，對間質浸潤＞1/2宮頸管壁、盆腔淋巴結轉移、脈管癌栓、切緣陽性等危險因素的患者術后加用外放射治療，全盆放療，同時予紫杉醇聯(lián)合卡鉑方案化療4療程。

NACT療效評價手術前 (化療結束后3周)行婦科檢查及影像學檢查 (B超、CT或核磁共振成像檢查)，根據(jù)宮頸腫瘤消退情況，判斷近期療效［18］。腫瘤消退情況按WHO實體瘤療效標準評定：完全緩解：婦科檢查及影像學檢查腫瘤完全消退;部分緩解：腫瘤病灶的最大直徑及其最大垂直橫徑的乘積縮小50%以上;穩(wěn)定：腫瘤病灶的兩徑乘積縮小不足50%，或增大不超過25%;進展：腫瘤病灶的兩徑乘積增大25% 以上或出現(xiàn)新病灶。將完全緩解和部分緩解判定為有效，穩(wěn)定和進展判定為無效。

試劑與儀器Trizol試劑盒購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒購自美國Bio-Rad公司，引物由廣州銳博生物公司設計，其余試劑均為國產分析純。NANODROPND-2000紫外分光光度計購自Thermo公司，熒光定量PCR儀Rotor Gene-6000購自德國Qiagen公司，凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

標本收集、總RNA的抽提與純化收集28例新輔助化療前、后宮頸鱗狀細胞癌患者組織標本。所有標本離體后30 min內，置于液氮凍存?zhèn)溆?。按照Trizol試劑盒使用說明書從組織中提取總RNA。紫外分光光度計測定RNA提取液的OD260、OD280吸光度值，計算純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

逆轉錄反應20 μl反應體系，25℃ 5 min，42℃30 min，再以85℃5 min滅活逆轉錄酶，產物-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

實時熒光定量PCR反應將逆轉錄產物稀釋至1～2倍，混勻。20 μl反應體系，先95℃ 3 min活化Tag酶，然后95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，共45個循環(huán)，72℃ 10 min延伸，所有反應均設3復孔。

miR-96表達水平的計算方法以U6為內參，測定循環(huán)閾值 (cycle threshold，Ct)，計算△Ct值，△Ct=miR-96平均Ct值-U6平均Ct值，而2-△△Ct表示新輔助化療前miR-96的表達相對于新輔助化療后的變化倍數(shù)，取新輔助化療后癌組織中miR-96的表達水平為1，以此為對照，計算宮頸癌患者新輔助化療前、后癌組織中miR-96的表達變化 (以倍數(shù)表示)［19］。ΔCt值與基因拷貝數(shù)呈反比，ΔCt值越高，基因的表達水平越低。2-△△Ct值越大說明新輔助化療前后miR-96的表達差異越大，代表化療效果越好。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，宮頸癌臨床病理參數(shù)與新輔助化療前后miR-96表達變化的相對定量結果之間的關系分析采用Mann-Whitney檢驗，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

miR-96在新輔助化療前、后組織中的相對表達量實時熒光定量PCR結果顯示，新輔助化療前組織中miR-96的相對表達量是化療后組織中的表達量的(5．330±5．069) 倍，差異具有統(tǒng)計學意義 (t=4．521，P=0．000)。

新輔助化療前后miR-96表達變化與臨床病理參數(shù)之間的關系miR-96的表達變化：中、低分化 (G2、G3級)者 (2．345±1．153)低于高分化 (G1級)者(9．941 ±5．359) (P=0．000); 間質浸潤深度 ＜1/2 間質者 (8．236±5．399) 高于≥1/2間質者 (1．978±1．030)(P=0．000); 有淋巴結轉移者 (1．848 ±0．959) 明顯低于無淋巴結轉移者 (7．942±5．348)(P=0．000);而年齡≤45歲、＞45歲，臨床分期為Ⅰb2期、Ⅱa期者化療前后miR-96的表達變化差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0．05)。

新輔助化療前、后宮頸癌組織中miR-96的表達水平與化療療效的關系所有患者NACT后，化療的總有效率為82．14%(23/28)，其中12例 (42．86%) 患者達到臨床完全緩解，無1例臨床進展病例。新輔助化療有效組 (完全緩解+部分緩解)與無效組 (病灶穩(wěn)定+疾病進展)相比，有效組化療后組織中miR-96表達水平 (14．937 ± 1．459) 與化療前 (12．677 ±1．162)相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義 (P=0．000)，miR-96 在無效組化療前 (10．479 ±0．294)、化療后 (10．372±0．403)組織中表達水平變化差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0．05)。新輔助化療前有效組組織中miR-96表達水平 (12．677±1．162) 明顯低于無效組 (10．479 ±0．294)(P=0．001)。

討 論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈逐年上升的趨勢且青年女性宮頸癌的發(fā)病呈明顯上升趨勢。雖然宮頸癌可以根據(jù)不規(guī)則陰道流血、陰道排液等癥狀，宮頸脫落細胞學檢查、電子陰道鏡下活檢等輔助檢查得到早期診斷，但仍有許多患者就診時已為晚期，臨床治療十分棘手。新輔助化療應用于治療局部晚期子宮頸癌顯示出良好的前景，可以使腫瘤降期、降低手術難度、獲得化療方案的體內敏感性，已經成為治療惡性腫瘤不可或缺的重要方法［20］，但由于腫瘤細胞對化療的敏感性不同、抗腫瘤藥物耐藥性等因素，如何預測宮頸癌新輔助化療療效及敏感性，正確選擇化療、放療等有效治療手段和把握最佳治療時機，提供患者更合理的個體化治療是臨床研究的重點。

本研究實時熒光定量PCR檢測結果顯示宮頸鱗狀細胞癌患者新輔助化療后組織中miR-96的表達水平明顯下降;新輔助化療前有效組腫瘤組織中miR-96表達水平明顯低于無效組的表達水平;化療臨床療效：中、低分化者低于高分化者，間質浸潤深度＜1/2間質者高于≥1/2間質者，有淋巴結轉移者明顯低于無淋巴結轉移者。由此推斷，化療前、后腫瘤組織中miR-96的表達水平變化與臨床療效關系密切，可作為宮頸鱗狀細胞癌新輔助化療療效及化療敏感性的重要預測因子。

目前關于小分子RNA表達的改變影響化療敏感性的研究剛剛開始，多數(shù)研究旨在闡明小分子RNA分子靶標機制與藥物敏感性和耐藥性間關系，如最近發(fā)現(xiàn)小分子RNA通過調控作為癌癥治療靶點或耐藥機制的關鍵基因 (表皮生長因子受體基因、多耐藥基因1、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因、程序性細胞死亡基因4等)，參與藥物的耐藥機制，影響抗腫瘤藥物的耐藥性，同時可作為個性化治療的重要的生物標志［21］;小分子RNA通過直接或間接調控其下游相關腫瘤基因的表達，促進腫瘤細胞凋亡，降低腫瘤細胞遷移和侵襲力，從而增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［22-24］?？鼓[瘤藥物能改變miR-96在宮頸癌組織中的表達，宮頸癌中miR-96的表達變化是否能影響抗腫瘤藥物的敏感性將有待進一步證實。有研究顯示新輔助化療能總體上降低宮頸鱗狀細胞患者組織中骨橋蛋白表達強度，延緩宮頸癌病情進展，且骨橋蛋白在宮頸癌組織中的表達強度與化療敏感性及化療效果有關［25］。因此：通過 miR-96介導RNA干擾技術沉默骨橋蛋白的表達，探討miR-96是否通過下調骨橋蛋白的表達從而促進宮頸癌細胞株(Hela)對卡鉑 (AUC 5)的敏感性，將成為進一步研究的重點，相信在未來局部晚期宮頸癌的治療進展中，針對miR-96和骨橋蛋白為靶點提高化療敏感性的腫瘤治療方面將會出現(xiàn)新的突破。

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Expressions of MicroRNA-96 Before and After Chemotherapy and Its Relationship with Chemosensitivity in Cervical Squamous Cell Carcinoma

ZHOU Wen，GUAN Ting

Department of Obstetrics and Gynecology，General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010，China

GUAN Ting Tel：020-88653527，E-mail：lxgdut@163．com

ObjectiveTo investigate the expression profiles of microRNA-96(miR-96)in cervical squamous cell carcinoma before and after neoadjuvant chemotherapy and to explore the effects of the treatment on expression of miR-96 and its relationship with clinical efficacy，chemosensitivity，and clinicopathologic features．MethodsThe expression of miR-96 was detected by real-time polymerase chain reaction in 28 patients with cervical squamous cell carcinoma(stage Ⅰb2-Ⅱa)before and after neoadjuvant chemotherapy．The correlations between the change of miR-96 and related clinicopathologic features of cervical cancer(age，pathologic pattern，histological grade，depths of interstitial infiltration，lymph node metastasis，and clinical stage)were further analyzed．ResultsThe relative expression of miR-96 in cervical squamous cell carcinoma before treatment was(5．330 ±5．069)times higher than after the treatment with neoadjuvant chemotherapy(P=0．000) ．The rela-tive change of the expressions of miR-96 in cervical cancer patients between pre-and post-neoadjuvant chemotherapy was closely related with clinicopathological features：it was significantly smaller in poorly-or moderately-differentiated patients(2．345 ±1．153)than in well-differentiated patients(9．941 ±5．359)(P=0．000)，significantly larger in patients with the tumor invasion depth ＜1/2 interstice(8．236 ±5．399)than in≥1/2 interstice(1．978 ±1．030)(P=0．000)，and significantly smaller in patients with lymph node metastasis(1．848 ±0．959)than those without lymph node metastasis(7．942 ± 5．348)(P=0．000) ．There was no significant difference in terms of age and clinical stages(Ⅰb2-Ⅱa)(P ＞0．05)．ConclusionNeoadjuvant chemotherapy can effectively reduce miR-96 expression in cervical squamous cell carcinoma tissues．It is therefore speculated that detection of the miR-96 expression before the chemotherapy for cervical cancer may be helpful to predict the therapeutic efficacy and sensitivity of the treatment．

cervical squamous cell carcinoma;microRNA-96;neoadjuvant chemotherapy;chemosensitivity

關 婷 電話：020-88653527，電子郵件：lxgdut@163．com

R711．74

A

1000-503X(2014)02-0140-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．02．005

2013-08-23)

·論 著·