楊浩娜， 柏連陽(yáng)，2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所，湖南長(zhǎng)沙 410128； 2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410125)

草甘膦是美國(guó)孟山都公司于20世紀(jì)70年代研制出的一種廣譜滅生性除草劑，可以防除一年生和多年生雜草。因?yàn)椴莞熟⒗砘再|(zhì)穩(wěn)定，具有內(nèi)吸傳導(dǎo)性、高效低毒、低殘留等其他除草劑所不具備的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為世界最主要的除草劑之一。我國(guó)自1980年開始生產(chǎn)草甘膦以來(lái)，逐漸成為全球生產(chǎn)和銷售草甘膦的中心[1]，起初草甘膦在我國(guó)僅在果園使用，后來(lái)隨著少耕免耕等耕作方式的改變和作物行間的定向保護(hù)性噴霧技術(shù)的發(fā)展[2]，使得草甘膦使用范圍得到進(jìn)一步擴(kuò)大。草甘膦現(xiàn)在既廣泛用于橡膠、桑、茶、果園等田地，也用于大豆、棉花、水稻、小麥等草本科農(nóng)田。長(zhǎng)期使用單一的除草劑必將加快雜草產(chǎn)生抗藥性。草甘膦具有獨(dú)特的作用方式和代謝機(jī)制，在土壤中殘留量極低，使人們認(rèn)為在田間不可能有雜草對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗藥性[3]。然而，1996年澳大利亞首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)抗草甘膦瑞士黑麥草(Loliumrigidum)之后，越來(lái)越多的抗草甘膦雜草在世界范圍內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，給草甘膦的應(yīng)用帶來(lái)了前所未有的挑戰(zhàn)，引起了國(guó)內(nèi)外專家的極大關(guān)注[3]。在國(guó)內(nèi)，越來(lái)越多的雜草被發(fā)現(xiàn)對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗藥性，如廣東省發(fā)現(xiàn)牛筋草對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗性[4]，湖南省、浙江省發(fā)現(xiàn)小飛蓬對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗性[5-6]等。因此，建立一套科學(xué)快速的抗草甘膦雜草檢測(cè)方法，為雜草抗藥性和農(nóng)田施藥指導(dǎo)等相關(guān)工作提供理論支撐意義深遠(yuǎn)。本研究總結(jié)歸納科學(xué)有效的抗草甘膦雜草檢測(cè)方法，旨在為農(nóng)田抗草甘膦雜草檢測(cè)體系的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 常用檢測(cè)方法

1.1 培養(yǎng)皿法

培養(yǎng)皿檢測(cè)法以其簡(jiǎn)單、快速、方便等特點(diǎn)[7]，一直被人們用于各類雜草抗藥性檢測(cè)試驗(yàn)當(dāng)中。Perez等和 Lenardo等利用培養(yǎng)皿法成功檢測(cè)了智利果園多花黑麥草(Loliummultiflorum)和巴西的馬唐(Digitariainsularis)對(duì)草甘膦的抗藥性水平[8-9]。培養(yǎng)皿檢測(cè)法首先需要將待測(cè)雜草種子打破休眠，然后配制等量不同濃度的草甘膦藥液，其濃度梯度設(shè)置為6～8個(gè)，一般設(shè)置為6個(gè)，其中1個(gè)為空白對(duì)照，待藥液均勻浸濕濾紙后，再將剛露白的種子放在培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放至恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)置待測(cè)雜草最適的溫度、濕度和光照條件。處理1～3周后，通過(guò)測(cè)定待測(cè)雜草種子的發(fā)芽數(shù)、主根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)等指標(biāo)，對(duì)其抗藥性水平進(jìn)行檢測(cè)。不同種群的雜草，其參照指標(biāo)并不相同。

1.2 整株檢測(cè)法

整株檢測(cè)法相對(duì)于培養(yǎng)皿檢測(cè)法來(lái)說(shuō)，其周期時(shí)間長(zhǎng)，占用空間大，但因其具有簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是檢測(cè)雜草抗藥性最普遍有效的方法[10]，也被國(guó)際雜草抗藥性管理組織推薦為主要檢測(cè)方法[11]。楊彩宏等利用整株檢測(cè)法成果地檢測(cè)出廣東省牛筋草(Eleusineindica)對(duì)草甘膦的抗性水平[4]。整株檢測(cè)法一般采用Ryary法，將待測(cè)雜草的種子打破休眠后，統(tǒng)一進(jìn)行盆栽，放置在溫室或者培養(yǎng)箱中，設(shè)置待測(cè)雜草最適的溫度、濕度和光照條件，雜草生長(zhǎng)期間定時(shí)澆水，定期拔出非目標(biāo)雜草。1～2個(gè)月后，待雜草長(zhǎng)到5 cm以上，一般為3～6葉期為宜，不同雜草應(yīng)根據(jù)本身?xiàng)l件而定。禾本科雜草一般為3～4葉期，闊葉雜草等須根據(jù)其生長(zhǎng)情況而定，一般以其生物量適合稱量為宜。處理前對(duì)待測(cè)雜草進(jìn)行間苗，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的為同一批次，用6～8個(gè)不同劑量的草甘膦溶液處理待測(cè)雜草，一般設(shè)置為6個(gè)，其中1個(gè)為空白對(duì)照，噴霧處理24 h內(nèi)最好不要對(duì)施藥雜草澆水。1～4周后，稱取雜草地上部分，測(cè)量其鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等指標(biāo)。不同雜草應(yīng)根據(jù)本身?xiàng)l件而定，不同劑量處理之后，待測(cè)雜草產(chǎn)生不同程度藥害表現(xiàn)情況即可。并根據(jù)施藥劑量和相應(yīng)指標(biāo)變化量得出線性回歸方程，計(jì)算出引起50%死亡的劑量RD50。

1.3 癥狀指數(shù)法

草甘膦處理雜草后，雜草會(huì)對(duì)應(yīng)出現(xiàn)葉片變黃、萎蔫等藥害癥狀，一般其嚴(yán)重程度和施藥劑量呈正相關(guān)。陳景超等根據(jù)雜草癥狀嚴(yán)重程度將其分為6個(gè)級(jí)別[12]。該方法前處理和整株檢測(cè)法一樣，待雜草噴藥后，1～4周左右出現(xiàn)藥害癥狀，可根據(jù)雜草的藥害表現(xiàn)，對(duì)應(yīng)相應(yīng)級(jí)別，記錄每個(gè)處理中每株雜草的級(jí)別，統(tǒng)計(jì)不同濃度處理雜草的總癥狀級(jí)別指數(shù)，得出線性回歸方程。癥狀指數(shù)法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可以同時(shí)和整株法聯(lián)用；但是由于各個(gè)癥狀級(jí)別之間的界限不明顯，植株癥狀表現(xiàn)形式劃分也帶有一定的主觀性，所以具有一定的局限性，一般不將其作為主要的檢測(cè)方法。

1.4 莽草酸含量法

草甘膦的作用機(jī)理主要是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，造成莽草酸堆積，合成過(guò)程受阻[13]，使植株不能正常生長(zhǎng)?？剐运讲灰恢碌碾s草被草甘膦處理過(guò)后，其植株體內(nèi)莽草酸含量變化的情況也不一樣，敏感種群植株會(huì)迅速積累大量莽草酸，明顯多于抗性種群[14]。因此，通過(guò)檢測(cè)比較雜草莽草酸含量變化，可以得出雜草是否產(chǎn)生抗藥性。Vangessle 和Feng等 通過(guò)測(cè)定莽草酸含量，得出小飛蓬(Conyzacanadensis)對(duì)草甘膦的抗藥性，其結(jié)果與整株法和培養(yǎng)皿法結(jié)果相同[15-16]。楊彩宏在檢測(cè)牛筋草(Eleusineindica)對(duì)草甘膦的抗性水平的試驗(yàn)中，也使用了莽草酸含量法，其結(jié)果也得到驗(yàn)證[4]。莽草酸含量法操作簡(jiǎn)單，不用大量重復(fù)試驗(yàn)。用草甘膦藥液處理長(zhǎng)勢(shì)一致的3～6葉期待測(cè)植株，以12 h為倍數(shù)設(shè)定樣品采集間隔，采集待測(cè)植株頂端葉片組織，用液相色譜儀或者紫外分光光度計(jì)測(cè)量雜草體內(nèi)莽草酸含量，依據(jù)雜草體內(nèi)莽草酸隨時(shí)間變化的趨勢(shì)可以得出雜草抗性情況。設(shè)置不同濃度的草甘膦藥液處理待測(cè)雜草，檢測(cè)莽草酸含量，也可以得出待測(cè)植株對(duì)草甘膦的抗性水平[17]。

2 其他檢測(cè)方法

2.1 EPSPS檢測(cè)法

EPSPS是草甘膦作用靶標(biāo)酶，通過(guò)測(cè)定草甘膦處理后植株靶標(biāo)酶活力的變化，檢測(cè)待測(cè)植株是否產(chǎn)生草甘膦抗藥性。Baerson等通過(guò)對(duì)剛性黑麥草(Loliumrigidum)EPSPS活力測(cè)定，檢測(cè)出不同剛性黑麥草對(duì)草甘膦產(chǎn)生不同抗性水平[18]。EPSPS檢測(cè)法類似于莽草酸含量法，但是其操作復(fù)雜，需要靈敏度高的儀器，成本也較高。而且并不是所有的抗草甘膦雜草在草甘膦處理后，其EPSPS活性都會(huì)增加，因此，不能成為抗草甘膦雜草的常用檢測(cè)方法，只適用于部分抗草甘膦雜草的檢測(cè)。

2.2 葉綠素含量法和葉綠素?zé)晒鈪?shù)法

草甘膦由植株莖葉的吸收，通過(guò)紊亂植株體內(nèi)蛋白質(zhì)合成過(guò)程，導(dǎo)致植株死亡，其雖然不屬于光合作用抑制劑類農(nóng)藥，但阮祚禧等[19]和卜貴軍等[20]認(rèn)為，草甘膦會(huì)對(duì)藍(lán)藻葛仙米(N.sphaeroides)和大豆的光合作用和葉綠素?zé)晒鈪?shù)產(chǎn)生影響，因此，通過(guò)測(cè)定葉綠素含量變化和葉綠素?zé)晒鈪?shù)能夠在一定程度上檢測(cè)抗草甘膦雜草的抗藥性水平。葉綠素含量法和葉綠素?zé)晒鈪?shù)法用不同濃度草甘膦處理長(zhǎng)勢(shì)一致的3～6葉期待測(cè)植株，處理1～2周后，隨機(jī)采取植株頂端第2層完全展開的葉片為測(cè)量對(duì)象，以24 h為倍數(shù)設(shè)定樣品采集間隔，規(guī)定采集時(shí)間段，采集樣品。葉綠素含量測(cè)定可選用丙酮和乙醇的混合液浸提法[21]，或者HPLC等方法[22]，得出施藥后不同抗性水平植株葉綠素a、葉綠素b的含量變化。管銘等[23]和楊彩宏等[4]都曾經(jīng)利用葉綠素?zé)晒鈪?shù)法檢測(cè)假稻種群[Leersiajaponica(Makino) Honda]和牛筋草(Eleusineindica)的敏感性和抗藥性。

2.3 DNA分析法

目前，大部分雜草對(duì)草甘膦抗藥性的機(jī)理研究都圍繞雜草DNA、RNA分子方面展開。根據(jù)植物基因的改變情況和程度，也可為其抗藥性水平推斷提供依據(jù)。通過(guò)采集待測(cè)植株的樣品，提取出總DNA，參考文獻(xiàn)資料或者基因庫(kù)設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增之后，獲取EPSPS基因目的片段進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)同種雜草的同源性比對(duì)分析，可以檢測(cè)雜草抗藥性。2004年Ng等通過(guò)提取不同地區(qū)牛筋草(Eleusineindica)的DNA，測(cè)序比對(duì)EPSPS基因片段，得出抗性種群基因突變的結(jié)果[24]。2010年Gaines等通過(guò)提取長(zhǎng)芒莧(Amaranthuspalmeri)的RNA，進(jìn)行同源性分析，也得出抗性和敏感種群之間的差異[25]。此類方法具有取樣簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，而且還可以同時(shí)為分析抗性產(chǎn)生的原因提供依據(jù)；但其重復(fù)性不高，每株雜草的突變點(diǎn)都不同，很難得出準(zhǔn)確的抗性水平，所以較少用來(lái)作為雜草抗性的檢測(cè)方法。

2.4 RT-PCR分析法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)技術(shù)1996年在美國(guó)推出之后，迅速在生物學(xué)各研究領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用，已經(jīng)成為一項(xiàng)不可或缺的重要技術(shù)。與常規(guī)PCR相比，RT-PCR具有更強(qiáng)的特異性，并且能對(duì)模板進(jìn)行定量分析。通過(guò)采集草甘膦處理后的待測(cè)植株，提取RNA，將其RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后，參考文獻(xiàn)資料或者基因庫(kù)設(shè)計(jì)合成引物，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，PCR擴(kuò)增之后，獲取帶有熒光基團(tuán)的EPSPS基因目的片段，根據(jù)Ct值可以得出起始模板拷貝數(shù)[26]，反映出草甘膦處理后雜草EPSPS的表達(dá)量差異，因此根據(jù)待測(cè)雜草EPSPS表達(dá)量的差異，可以檢測(cè)雜草抗藥性。Gaines等通過(guò)提取長(zhǎng)芒莧(Amaranthuspalmeri)的RNA，進(jìn)行RT-PCR分析，得出抗性和敏感種群之間EPSPS表達(dá)量的差異[25]。

3 結(jié)論

隨著草甘膦使用范圍的擴(kuò)大和使用量、使用年限的增加，抗草甘膦雜草種類數(shù)目快速增長(zhǎng)[27-28]。除了本研究提及的檢測(cè)方法，雜草抗藥性檢測(cè)還有其他方法，如分蘗檢測(cè)法、花粉粒檢測(cè)法等，由于這類方法實(shí)際操作中存在不足之處，所以沒有用于雜草對(duì)草甘膦抗藥性的檢測(cè)。目前雜草對(duì)草甘膦抗藥性檢測(cè)中，運(yùn)用最廣泛的是整株檢測(cè)法，該法簡(jiǎn)單易行，可以同時(shí)進(jìn)行大量樣本檢測(cè)，而且結(jié)果準(zhǔn)確性較高，但所需時(shí)間較長(zhǎng)。而莽草酸含量法以及葉綠素含量法、葉綠素?zé)晒鈪?shù)法前期雜草處理跟整株檢測(cè)法是相同的，因此，可以將這幾種方法結(jié)合起來(lái)同時(shí)使用，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，完善雜草對(duì)草甘膦抗藥性的檢測(cè)體系。雜草DNA、RT-PCR分析檢測(cè)法取樣簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，雖尚處于起步階段，但值得進(jìn)行深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]梁 誠(chéng). 草甘膦生產(chǎn)現(xiàn)狀與市場(chǎng)分析[J]. 精細(xì)化工原料及中間體，2011(8)：13-15.

[2]劉 延，崔海蘭，黃紅娟，等. 抗草甘膦雜草及其抗性機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(1)：10-14.

[3]Bradshaw L D，Padgette S R，Kimball S L，et al. Perspectives on glyphosate resistance[J]. Weed Technology，1997，11(1)：189-198.

[4]楊彩宏，田興山，馮 莉，等. 牛筋草對(duì)草甘膦的抗藥性[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(10)：2093-2098.

[5]唐吉和，戴良英. 生物測(cè)定法測(cè)定苧麻園小飛蓬對(duì)草甘膦的抗藥性試驗(yàn)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011(21)：182-183.

[6]Song X L，Wu J J，Qing S. Establishment of a test method of glyphosate-resistantConyzacanadensisin China[C]//The 20th Asian-Pacific Weed Science Society Conference Agriculture Publishing，2005：499-504.

[7]Kotoula-Syka E，Tal A，Rubin B. Diclofod-resistantLoliumrigidumfrom northern Greece with cross-resistance to ACCase inhibitors and multiple resistance to chlorsulfuron[J]. Pest Management Science，2000，56(12)：1054-1058.

[8]Perez A，Kogan M. Glyphosate-resistantLoliummultiflorumin Chilean orchards[J]. Weed Research，2003，43(1)：12-19.

[9]Lenordo B C，Hugo C H，F(xiàn)rdel G T，et al. Detection of sourgrass(Digitariainsularis) biotypesresistant to glyphosate in Brazil[J]. Weed Science，2011，59(2)：171-176.

[10]王慶亞，董立堯，婁遠(yuǎn)來(lái)，等. 農(nóng)田雜草抗藥性及其檢測(cè)鑒定方法[J]. 雜草科學(xué)，2002(2)：1-5.

[11]Moss S. Detecting herbicide resistance[EB/OL]. [2014-09-22]. http：//www.plantprotection.org/hrac/detecting.html.

[12]陳景超，張朝賢，黃紅娟，等. 抗草甘膦雜草及其檢測(cè)方法發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 植物保護(hù)，2011，37(6)：44-47，54.

[13]Herrmann K M，Weaver L M. The Shikimate pathway[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1999，50：473-503.

[14]Mueller T C，Massey J H，Hayes R M，et al. Shikimate accumulates in both glyphosate-sensitive and glyphosate-resistant horseweed (ConyzacanadensisL. Cronq.)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(3)：680-684.

[15]Vangessel M J. Glyphosate-resistant horseweed from Delaware[J]. Weed Science，2001，49(6)：703-705.

[16]Feng P C，Tran M，Chiu T，et al. Investigations into glyphosate-resistant horseweed(Conyzacanadensis)：retention，uptake，translocation，and metabolism[J]. Weed Science，2004，52(4)：498-505.

[17]Shaner D L，Nadler-Hassar T，Henry W B，et al. A rapidinvivoshikimate accumulation assay with excised leaf discs[J]. Weed Science，2005，53(6)：769-774.

[18]Baerson S R，Rodriguez D J，Biest N A，et al. Investigating the mechanism of glyphosate resistance in rigid ryegrass(Loliumrigidum)[J]. Weed Science，2002，50(6)：721-730.

[19]阮祚禧，Murray T B. 草甘膦對(duì)可食用藍(lán)藻葛仙米生長(zhǎng)和生理的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2008，32(4)：462-468.

[20]卜貴軍，劉洪梅，李 英，等. 草甘膦對(duì)大豆超微結(jié)構(gòu)及光合指標(biāo)影響的研究[J]. 電子顯微學(xué)報(bào)，2008，27(4)：322-330.

[21]李得孝，郭月霞，員海燕，等. 玉米葉綠素含量測(cè)定方法研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21(6)：153-155.

[22]張 伏，張亞坤，毛鵬軍，等. 植物葉綠素測(cè)量方法研究現(xiàn)狀及發(fā)展[J]. 農(nóng)機(jī)化研究，2014(4)：238-241.

[23]管 銘，郭水良，裴 立，等. 基于光合和葉綠素?zé)晒鈪?shù)評(píng)判兩個(gè)假稻種群對(duì)草甘膦的敏感性[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，41(2)：171-178.

[24]Ng C H，Wickenswary R，Salmijah S，et al. Glyphosate resistance inEleusineindica(L.) Gaertn. from different origins and polymerase chain reaction amplification of specific alleles [J]. Australian Journal of Agricultural Research，2004，55：407-414.

[25]Gaines T A，Zhang W L，Wang D F，et al. Gene amplification confers glyphosate resistance inAmaranthuspalmeri[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107(3)：1029-1034.

[26]胡丹丹，顧金剛，姜瑞波，等. 定量RT-PCR及其在植物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2007，13(3)：520-525.

[27]鞏元勇，郭書巧，束紅梅，等. 抗草甘膦雜草的抗性機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 雜草科學(xué)，2012，30(3)：9-13.

[28]彭學(xué)崗，金 濤，張景遠(yuǎn). 除草劑面臨的挑戰(zhàn)及草甘膦復(fù)配的意義[J]. 雜草科學(xué)，2013，31(1)：5-9.