曹勤琛 趙路軍 王平

肺癌在男性的腫瘤相關(guān)性死亡中占首位，在女性的腫瘤相關(guān)性死亡中占第二位，目前已成為世界范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因之一[1]。非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的85%，其中肺腺癌在NSCLC中所占的比例呈逐年增長的趨勢。盡管近些年來診斷和治療手段得到了不斷的改進，但是NSCLC患者的5年生存率（約15%）卻未得到明顯提高。轉(zhuǎn)移是NSCLC患者的主要死因之一。但是，腫瘤細胞的具體轉(zhuǎn)移機制仍然不是十分明確[2]。近期研究[3-6]發(fā)現(xiàn)，NSCLC等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移與上皮細胞-間葉細胞轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）的發(fā)生密切相關(guān)。

1 EMT的定義與鑒別

傳統(tǒng)的研究是從形態(tài)學上區(qū)分上皮細胞和間葉細胞[7]，因此，EMT往往被簡單定義為從形態(tài)規(guī)則的上皮細胞向形態(tài)不規(guī)則的間葉細胞的轉(zhuǎn)變。典型的肺上皮細胞彼此之間連接緊密，排列也十分規(guī)則[8]。上皮細胞還具有頂面和基底面之分，這種特征被定義為上皮細胞的“極性”。上皮細胞的兩種不同表面與不同的基質(zhì)相連。上皮細胞間的這種排列方式能夠阻止上皮細胞從組織中脫離。肺的間葉細胞恰恰相反[9]。間葉細胞間的連接十分不緊密，排列方式也十分不規(guī)則。間葉細胞的外形十分瘦長，這種形態(tài)有利于間葉細胞的運動。因此，間葉細胞的運動比上皮細胞活躍，二者的運動方式十分不同。

分子生物學研究發(fā)現(xiàn)EMT發(fā)生的過程不僅是細胞形態(tài)的改變，還伴隨著相關(guān)分子標記物的改變。例如，E-cadherin僅在上皮細胞中表達，而不在間葉細胞中表達[10]。因此，Hay[11]將EMT定義為細胞逐步喪失上皮細胞標志物，同時逐步獲得間葉細胞標志物的過程。其中，上皮細胞標志物包括E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、斑珠蛋白（plakoglobin）、細胞角蛋白（cytokeratins）等，而間葉細胞標志物包括N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、α平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin,α-SMA）等。因此，應該至少從形態(tài)學和分子生物學兩個方面鑒別某種腫瘤是否發(fā)生了EMT。

2 EMT的發(fā)生機制

腫瘤細胞發(fā)生EMT需要一定的誘因，而引起EMT發(fā)生的誘導因子可分為內(nèi)源性的和外源性的。其中，內(nèi)源性誘因包括某些基因的突變或過表達。突變后能夠?qū)е翬MT發(fā)生的基因包括p53等[12]；過表達后能夠?qū)е翬MT發(fā)生的基因包括K-ras、c-myc和RGC32等[13-15]。這些基因發(fā)生異常后不但能夠使細胞的形態(tài)發(fā)生改變[13]，而且還能夠下調(diào)上皮細胞標志物的表達[12]，同時上調(diào)間葉細胞標志物的表達[14,15]。外源性誘因包括吸煙、乏氧誘導因子（hypoxia inducible factor, HIF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor β, TGF-β）等多種因素[16-18]。其中，吸煙能夠通過上調(diào)淋巴樣增強因子1（lymphoid enhancer factor 1, LEF1）和轉(zhuǎn)錄因子Slug，募集組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase, HDAC），進而抑制E-cadherin的表達，促進EMT的發(fā)生[16]。HIF-2α能夠在mRNA水平上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Zeb1以及間葉細胞標記物vimentin的表達，促進EMT的發(fā)生[17]。TGF-β能夠通過Smad依賴性信號通路[19]或非Smad依賴性信號通路[20]抑制上皮細胞相關(guān)標記物E-cadherin等的表達，同時促進間葉細胞相關(guān)標記物N-cadhein等的表達。

如上所述，某些轉(zhuǎn)錄因子也參與了EMT的發(fā)生。與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制因子大致可分為兩類：一類能夠直接抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄和活性，如Snail1、Snail2和E47等[21]；另一類間接抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，如Twist等[22]。值得注意的是，Snail可以通過抑制清道夫受體A5（scavenger receptor class A member 5, SCARA5）的表達促進NSCLC發(fā)生EMT，這一機制與其他腫瘤不太相同[23]。目前，Snail是否必須受上游信號的調(diào)節(jié)才能夠激活EMT尚無定論，仍然需要進一步研究。

NSCLC發(fā)生EMT不僅僅與誘導因子和轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，還與某些信號通路密切相關(guān)。Hedgehog通路是在研究果蠅胚胎時首次被發(fā)現(xiàn)的，與細胞的生長、侵襲密切相關(guān)，對NSCLC細胞的存活十分關(guān)鍵[24,25]。這一通路中關(guān)鍵的效應分子包括Gli轉(zhuǎn)錄因子等鋅指蛋白。Gli1能夠迅速促進Snail的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)節(jié)E-cadherin的表達，促進NSCLC發(fā)生EMT[25]。Mizuarai等[26]研究發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S6激酶p70S6K2是Gli的下游效應分子。通過抑制p70S6K2可以抑制NSCLC細胞系中Hedgehog通路的激活。Maitah等[27]研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog通路還可以與其他通路共同作用，比如通過上調(diào)配體Shh可以增強TGF-β對EMT的誘導作用。因此，Hedgehog通路既可以直接導致NSCLC發(fā)生EMT，也可以聯(lián)合TGF-β等其他通路間接促進NSCLC發(fā)生EMT。并且，Hegehog通路促進NSCLC發(fā)生EMT的具體機制比既往的研究復雜得多，需要進一步深入的研究。

環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase 2, COX-2）是一種誘導酶，能夠催化花生四烯酸和類花生酸前列腺素合成，具有抗凋亡、促增殖、促進EMT發(fā)生的作用，與NSCLC患者的預后密切相關(guān)[28]。前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）是COX-2的一種代謝產(chǎn)物，能夠促進免疫抑制、誘導肺癌中EMT的發(fā)生[29]。在COX-2/PGE2通路中，PGE2通過上調(diào)Zeb1和Snail進而促進EMT的發(fā)生[30]。基于以上理論，研究人員研發(fā)出了一些COX-2抑制劑（如阿利考西），希望借此能夠治療NSCLC[31]。但是近期的研究[32]發(fā)現(xiàn)，并非所有的COX-2抑制劑都能夠逆轉(zhuǎn)EMT。有些COX-2抑制劑，如塞來昔布（celecoxib）反而能夠促進EMT的發(fā)生。因此，在研制和應用COX-2抑制劑時應當十分慎重。

與EMT相關(guān)的TGF-β通路可分為兩種：一種需要轉(zhuǎn)錄因子Smad參與[19]，而另一種不需要Smad參與[20]。在Smad依賴性TGF-β通路中，TGF-β首先與受體結(jié)合，激活的TGF-β受體I促使轉(zhuǎn)錄因子Smad2和Smad3發(fā)生磷酸化，發(fā)生磷酸化的Smad2、Smad3與Smad4結(jié)合形成三聚物[19]。這種三聚物再被轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子一起調(diào)節(jié)TGF-β靶基因（如E-cadherin基因）的表達[19]。但是，Chen等[20]發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導NSCLC發(fā)生EMT往往是通過PI3K/Akt通路和MEK/Erk1/2通路等不依賴Smad的通路進行的。

此外，核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）通路、Notch通路和Wnt通路也能促進EMT的發(fā)生。但是，多項研究[33-37]表明這些通路主要促進乳腺癌等其他腫瘤發(fā)生EMT。在NF-κB通路中，NF-κB能夠通過激活Twist和Snail促進EMT的發(fā)生[34,38]。有研究[33]還發(fā)現(xiàn)，包括Ras在內(nèi)的許多EMT相關(guān)基因的激活是通過NF-κB通路進行的。這說明NF-κB通路可能遠比目前的研究結(jié)果復雜，仍需要更進一步研究。在Notch通路中，轉(zhuǎn)錄因子Jagged1和Notch1的過表達可以誘導轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達，而Slug通過抑制E-cadherin的表達、激活β-catenin以及抵抗失巢凋亡來促進EMT的發(fā)生[39]。Sahlgren等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，Notch能夠誘導HIF-1α向賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase, LOX）聚集，進而增強乏氧介導的LOX上調(diào)，而LOX具有穩(wěn)定Snail（Slug）蛋白的作用。因此，他們認為Notch通路可以通過介導乏氧刺激EMT的發(fā)生[35]。在Wnt通路中，Wnt蛋白能夠與Frizzled受體結(jié)合，進而在Frizzled受體、脂蛋白受體相關(guān)性蛋白（lipoprotein receptor related protein, LRP）、Dishevelled分子和軸抑制蛋白（Axis inhibition protein, Axin）之間形成一種穩(wěn)定的受體復合物，使Dishevelled分子發(fā)生磷酸化[36]。磷酸化的Dishevelled分子會抑制GSK-3β活性，而GSK-3β又具有促使轉(zhuǎn)錄因子Snail1發(fā)生磷酸化的作用[37]。這樣，Snail1就會在細胞中不斷積累，最終促使EMT的發(fā)生[37]。目前仍需要大量研究證實NSCLC是否也能夠通過這些通路發(fā)生EMT。

3 EMT與miRNA

miRNA（或microRNA）是一種長度為20個-22個核苷酸的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA），能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達[40]。在EMT相關(guān)的miRNA中，miR-200被研究得最多[41]。miRNA-200能夠下調(diào)Zeb1 mRNA和Zeb2 mRNA的水平，上調(diào)E-cadherin水平[42]，抑制EMT的發(fā)生，進而抑制NSCLC的轉(zhuǎn)移[43]。最近的研究[44]發(fā)現(xiàn)，MiR-134/487b/655能夠通過抑制膜相關(guān)性鳥苷酸激酶的活性進而抑制肺腺癌中EMT的發(fā)生，減少肺腺癌對吉非替尼的耐藥性。而miR-30a能夠下調(diào)Snail的表達進而影響NSCLC細胞中E-cadherin和N-cadherin的表達水平[45]。但是，Kong等[46]發(fā)現(xiàn)，TGF-β在誘導小鼠乳腺上皮細胞發(fā)生EMT的同時還能夠促進miR-155的表達。降低細胞中miR-155水平反而能夠抑制EMT的發(fā)生、抑制細胞間緊密連接的降解，進而抑制細胞的侵襲性。反之，增加miR-155水平能夠促進EMT的發(fā)生，增強細胞的侵襲性。NSCLC中是否也存在這種現(xiàn)象仍然不十分清楚。這說明miRNA調(diào)節(jié)EMT發(fā)生的機制不盡相同。

既然miRNA能夠抑制EMT而EMT又與NSCLC的轉(zhuǎn)移相關(guān)，那么miRNA能否有效地預測NSCLC的預后呢？Gao等[47]發(fā)現(xiàn)miR-21的高表達（HR=5.993, 95%CI:2.518-14.264; P＜0.001）、miR-181a的低表達（HR=0.328,95%CI: 0.142-0.756; P=0.009）與患者的總生存期密切相關(guān)，而與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)。Li[48]的研究也發(fā)現(xiàn)miR-146的高表達與NSCLC患者的預后密切相關(guān)，而與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)?？梢姡琺iRNA與NSCLC的總生存期相關(guān)，而其預后價值仍需要更深入的研究。

4 EMT與腫瘤干細胞

腫瘤干細胞（cancer stem cells, CSC）是能夠自我更新并能夠分化成多種腫瘤細胞系的一類細胞。腫瘤干細胞理論最初只是一種設想，直到1997年首次通過實驗證明腫瘤干細胞的存在[49]。Mani等[50]首次報道了EMT的發(fā)生能夠?qū)е履[瘤細胞成為腫瘤干細胞。他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過球體培養(yǎng)的上皮細胞可以向干細胞樣細胞轉(zhuǎn)變，并且能夠獲得間葉細胞的某些表型[50]。Pirozzi等[51]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過TGF-β1處理的NSCLC細胞系不但發(fā)生了EMT，還能夠表達腫瘤干細胞的某些分子標記物，如Oct4、Nanog、Sox2、c-kit和CD133等。因此，我們推測，所謂EMT或許就是上皮細胞向腫瘤干細胞轉(zhuǎn)變的一個過程。如果這一猜想成立的話，那新的問題出現(xiàn)了：既然腫瘤干細胞是能夠自我更新并能夠分化成多種腫瘤細胞系的一類細胞，那腫瘤干細胞的分化是否也能夠?qū)е翬MT的發(fā)生。這些猜想尚需要大量的研究證實。

5 EMT與NSCLC預后的相關(guān)性

目前，有關(guān)EMT與NSCLC預后的研究多數(shù)是從相關(guān)標記物的臨床意義入手的。與EMT相關(guān)的分子標志物包括上皮細胞標志物以及間葉細胞標志物、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等[6,11]。

E-cadherin是上皮細胞特異性標志物，表達水平在EMT的發(fā)生過程中逐漸降低[11]。Sulzer等[4]發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達情況與NSCLC患者的預后密切相關(guān)。111例接受手術(shù)的患者中，高表達E-cadherin的患者的3年生存率是60%，而低表達E-cadherin的患者的3年生存率僅32%。但是，Tarin[52]通過回顧文獻及自己既往的研究后認為EMT在腫瘤的進展中并不一定具有意義。Prudkin等[53]發(fā)現(xiàn)：E-cadherin表達的減少和N-cadherin的過表達與肺癌的預后不相關(guān)，且?guī)缀跛械姆伟吮径即嬖贓MT表型的變化。他們還發(fā)現(xiàn)，與肺癌的原發(fā)灶相比，腦轉(zhuǎn)移瘤能夠表達更高水平的E-cadherin[53]。Wu等[5]對13項研究中的2,274例患者進行了meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin的下降確實與NSCLC患者的預后相關(guān)，但是與I期患者的預后無關(guān)。

因此，EMT相關(guān)標志物與NSCLC患者預后的具體關(guān)系需要進一步研究及更加深入的分析，而首先需要解決的問題是篩選更多可供肺癌研究借鑒的相關(guān)標記物。例如，N-cadherin和Vimentin是間葉細胞特異性標志物，其表達水平在EMT的發(fā)生過程中逐漸增加[11]，同樣可以作為檢測EMT發(fā)生的特異性指標。Luo等[54,55]發(fā)現(xiàn)胞核中N-cadherin和Vimentin的陽性表達率與鼻咽癌患者的臨床分期相關(guān)（P＜0.001）。既然如此，N-cadherin和Vimentin與NSCLC的臨床分期是否也存在一定的相關(guān)性呢？Hui等[6]發(fā)現(xiàn)III-IV期與I期和II期NSCLC中N-cadherin的表達陽性率分別為39.58%、31.58%和23.53%（P＜0.01），而低、中、高分化NSCLC中N-cadherin表達陽性率分別為64.10%、35.71%和16.0%（P＜0.01）。Dauphin等[56]發(fā)現(xiàn)Vimentin的高表達與NSCLC的遠處轉(zhuǎn)移（P=0.024）和較晚分期（P=0.002,8）相關(guān)?？梢姡琋-cadherin和Vimentin的表達情況與NSCLC的分期同樣存在一定的相關(guān)性。

轉(zhuǎn)錄因子在EMT的發(fā)生過程中有十分重要的調(diào)控作用，那么通過檢測腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄因子的表達情況應該可以明確EMT的發(fā)生情況及其預后價值。Yin等[57]對107例骨肉瘤標本進行免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中Twist的陽性表達率為31.8 %（34/107） ，并且Twist表達陽性的骨肉瘤患者在總生存期和無進展生存期方面均較差（P＜0.05）。類似地，Hui等[6]發(fā)現(xiàn)NSCLC中Twist的表達陽性率為38%，明顯高于瘤旁正常組織（P＜0.01）。并且，Twist的表達情況與NSCLC的分期和分級相關(guān)。III期-IV期NSCLC中Twist的表達率（56.25%）明顯高于I期（21.05%, P＜0.01）或II期（32.35%, P＜0.01）。低分化癌與中分化和高分化癌中Twist的表達陽性率也各不相同，分別為66.67%、26.79%和20.00%（P＜0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中Twist的表達情況也存在一定的差異（48.58% vs 24.0%, P＜0.01）。這說明，Twist對NSCLC同樣具有預后意義。但是，Twist的過表達并不是NSCLC的獨立預后因素，與N-cadherin的過表達呈一定的相關(guān)性（R=0.565, P＜0.001）[6]。

盡管上述的研究表明EMT相關(guān)的標記物與NSCLC患者的預后存在一定相關(guān)性，但這些研究僅僅是從分子生物學方面對EMT進行研究。既然EMT的鑒別至少需要從形態(tài)學和分子生物學兩個方面進行，那么研究人員也應該將形態(tài)學因素考慮在內(nèi)。

6 問題與展望

目前，有關(guān)EMT的研究雖然取得了一定的成果，但仍然面臨許多問題。首先，多數(shù)研究表明EMT相關(guān)標志物與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈一定的相關(guān)性，但這些研究并未證明EMT與腫瘤進展是否真的存在一定的順序關(guān)系或因果關(guān)系。Chui[58]認為，累積的遺傳學和表觀遺傳學改變以及腫瘤微環(huán)境才是導致腫瘤獲得侵襲性的重要因素，而EMT并非腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的必要步驟。可見，EMT與腫瘤進展的關(guān)系尚存在一定的爭論，仍需要深入的研究。其次，EMT相關(guān)基礎研究應該不斷地應用于臨床。例如，Brachyury是最近發(fā)現(xiàn)的一種T-box轉(zhuǎn)錄因子，能夠在多種腫瘤中表達[59]。Brachyury的高表達能夠誘導上皮細胞發(fā)生EMT。針對這種轉(zhuǎn)錄因子，研究人員研發(fā)出了一種腫瘤疫苗，希望能夠用這種疫苗治療晚期NSCLC[60]。因此，在解決相關(guān)爭論的同時，不斷將EMT與NSCLC的免疫治療相結(jié)合或許是未來的研究方向之一。