王 穎，陳英紅，羅浩銘，姜瑞芝，姜翔之

（1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)藥基礎(chǔ)所，長(zhǎng)春 130012；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春 130033）

人參三肽的序列分析

王 穎1，陳英紅1，羅浩銘1，姜瑞芝1，姜翔之2

（1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)藥基礎(chǔ)所，長(zhǎng)春 130012；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春 130033）

采用Sephadex LH－20色譜柱，以體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇為流動(dòng)相分離人參中具有增強(qiáng)記憶活性的肽類成分，通過高效液相色譜系統(tǒng)將其純化，并用蛋白質(zhì)測(cè)序儀分析其氨基酸序列.結(jié)果表明，所得序列為Gln－Thr－Ser的新三肽.

人參；氨基酸；序列分析；三肽

人參（PanaxginsengC.A.Mey.）為五加科植物，是我國(guó)名貴的中草藥.目前對(duì)人參中肽的研究較多，但都未給出其一級(jí)結(jié)構(gòu)［1－6］.人參水提物中分子量相對(duì)較低的部分具有增強(qiáng)小鼠記憶的作用［7］，分離純化該部分可得寡糖、糖肽與肽部分，藥理實(shí)驗(yàn)表明，具有增強(qiáng)記憶作用的活性部位為肽類［6］.本文對(duì)此肽類成分經(jīng)Sephadex LH－20柱以及高相液相色譜系統(tǒng)進(jìn)一步純化后，通過序列分析，得到三肽結(jié)構(gòu)，為首次從人參中提取，并確定其一級(jí)結(jié)構(gòu).

1 試劑與儀器

人參多肽（PGP1）為吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)藥基礎(chǔ)所制備［6］.L－色氨酸、細(xì)胞色素C、抑肽酶和維生素B12購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；Sephadex LH－20為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；玻璃纖維膜、聚四氟乙烯（PTFE）濾膜、聚凝胺和混合氨基酸標(biāo)品（PTH－AA）均為日本島津公司產(chǎn)品；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純.

754紫外分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；BSZ－100A型自動(dòng)部分收集器，HL－1恒流泵（上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品）；Christ Alphal－2型冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）；高效液相色譜系統(tǒng)（HPLC，日本島津公司）：10AT－VP泵、紫外檢測(cè)器和PPSQ－31A型蛋白質(zhì)測(cè)序儀（日本島津公司）；快速蛋白液相色譜（FPLC）系統(tǒng)（瑞典Pharmacia公司）.

2 方 法

2.1 PGP1的純化 稱取235 mg PGP1，加入p H＝7.0的磷酸鈉緩沖液1 m L，溶解后通過Sephadex LH－20（2.5 cm×95 cm）分離［8］，以p H＝7.0磷酸鈉緩沖液洗脫，流速0.1 m L／min，每管2 m L，以280 nm的吸收值對(duì)肽進(jìn)行監(jiān)測(cè)，繪制洗脫曲線.

2.2 人參三肽的制備 1）HPLC純化：采用凝膠分析柱（OHpak SB－802型，日本Shodex公司），流動(dòng)相為p H＝7.0的磷酸鹽緩沖液，流速0.5 m L／min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm.2）FPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)鑒定：采用MonoQ柱（HR10／5柱，瑞典Pharmacia公司），流動(dòng)相為0.1 mol／L NaCl［9］，流速1 m L／min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm.

2.3 氨基酸序列分析 利用PTH－AA生成標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，對(duì)混合氨基酸標(biāo)品的保留時(shí)間進(jìn)行校正，生成標(biāo)準(zhǔn)方法文件.將15μL聚凝胺置于玻璃纖維膜上，氮?dú)獯蹈?將樣品加至預(yù)處理后的玻璃纖維膜上，氮?dú)獯蹈?，用PTFE濾膜封置于蛋白測(cè)序儀的反應(yīng)器內(nèi)，設(shè)定檢測(cè)氨基酸數(shù)進(jìn)行檢測(cè).

3 結(jié)果與討論

3.1 人參多肽的純化 PGP1通過Sephadex LH－20凝膠柱純化的洗脫曲線如圖1所示.由圖1可見，洗脫曲線存在3個(gè)峰.第二個(gè)峰的吸收值相對(duì)較高，即樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高，收集此部分，濃縮凍干，命名為PGP1a.

3.2 HPLC法制備三肽 利用HPLC測(cè)定PGP1a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖2所示.由圖2可見，其HPLC譜存在3個(gè)單峰.分別富集此3個(gè)組分，通過FPLC測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示保留時(shí)間為21.21 min的組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，富集此部分，命名為PGP1aa.

圖1 PGP1的Sephadex LH－20凝膠柱純化洗脫曲線Fig.1 Elution profile of PGP1 purified by DEAE－Sephadex LH－20 column

圖2 PGP1a的HPLC譜Fig.2 HPLC spectrogram of PGP1a

圖3 PGP1aa的氨基酸序列分析色譜Fig.3 Amino acid sequence spectrograms of PGP1aa

3.3 氨基酸序列分析 采用蛋白質(zhì)測(cè)序儀對(duì)PGP1aa進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如圖3所示.由圖3可見，序列為Gln－Thr－Ser.

綜上所述，本文采用Sephadex LH－20凝膠柱與HPLC對(duì)人參多肽進(jìn)行分離純化，再通過蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列，得到了序列為Gln－Thr－Ser的三肽.此三肽為首次從人參中分離純化得到，并確定了其結(jié)構(gòu).

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Sequential Analysis of Tripeptide fromPanaxginseng

WANG Ying1，CHEN Yinghong1，LUO Haoming1，JIANG Ruizhi1，JIANG Xiangzhi2
（1.InstiuteofBasicTraditionalChineseMedicine，JilinAcademyofChineseMedicineand MaterialMedicaScience，Changchun130012，China；2.China－JapanUnionHospital，JilinUniversity，Changchun130033，China）

The peptides，which show enhanced memory effect，fromPanaxginsengwere separated on a Sephadex LH－20 column，the mobile phase was volume fraction 10%of methanol，and purified by HPLC.Then the amino acid sequence was analysed by protein sequencer.The results of amino acid sequential analysis showed that a novel tripeptide whose amino acid sequence is Gln－Thr－Ser was obtained.

Panaxginseng；amino acid；sequential analysis；tripeptide

R932

A

1671－5489（2014）04－0852－03

10.13413／j.cnki.jdxblxb.2014.04.43

2013－11－06.

王 穎（1981—），女，漢族，博士，從事天然藥物化學(xué)的研究，E－mail：wangying02231＠sina.com.通信作者：姜翔之（1956—），男，漢族，主管藥師，從事臨床藥學(xué)的研究，E－mail：zhongyanjrz＠sina.com.

國(guó)家自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：81173532）、吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（批準(zhǔn)號(hào)：20130206046YY）和吉林省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（批準(zhǔn)號(hào)：2012－114）.

單 凝）