李明明， 虞艷云， 王 進(jìn)， 李 青， 岳正波

（合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

硫酸鹽還原菌（sulfate reducing bacteria，簡稱SRB）是一類形態(tài)、營養(yǎng)多樣化的厭氧異養(yǎng)細(xì)菌［1］。文獻(xiàn)［2－3］研究表明，SRB菌可以有效地去除廢水中的重金屬離子，并在處理礦山酸性排水中具有重要作用。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)SRB胞外聚合物（extracellular polymeric substances，簡稱EPS）在處理重金屬的過程中占有重要作用。文獻(xiàn)［4］認(rèn)為EPS在生物修復(fù)重金屬中起核心作用；文獻(xiàn)［5］研究從海水中分離一株SRB，在液體培養(yǎng)時(shí)其分泌的EPS與Ni2＋、Cr6＋與Mo2＋形成配體，可以有效去除這幾種重金屬。

EPS是微生物在生長過程中分泌的一種由多糖、蛋白質(zhì)等許多高分子物質(zhì)組成的聚合物［6－7］。EPS含有大量陰離子基團(tuán)（羧基、羥基及氨基等）［8］，可以和重金屬離子進(jìn)行吸附或螯合等作用［9－10］。文獻(xiàn)［11］研究 Mn2＋、Mo6＋和Zn2＋對活性污泥內(nèi)EPS組分的影響，結(jié)果表明低質(zhì)量濃度（0.05mg／L）Mn2＋導(dǎo)致EPS中蛋白質(zhì)、多糖和核酸的含量下降，Zn2＋會對EPS中多糖含量造成影響，Mo6＋對EPS各組分沒有顯著影響。文獻(xiàn)［12］研究pH值對EPS吸附重金屬的影響，發(fā)現(xiàn)有30%的重金屬吸附到EPS上是不可逆的。

隨著人們對EPS研究的深入，如何調(diào)節(jié)EPS的成分和含量已經(jīng)成為目前一個(gè)現(xiàn)實(shí)的問題。大量研究表明培養(yǎng)時(shí)間、基質(zhì)、pH值等生長因子可以影響細(xì)菌EPS的分泌。文獻(xiàn)［13］分別研究了培養(yǎng)時(shí)間、C／N比等對Rhodopseudomonasacidophila分泌EPS的影響；文獻(xiàn)［14］研究了環(huán)境因素對Pediococcusparvulus2.6分泌EPS的影響；文獻(xiàn)［15］研究了pH值、接種量、培養(yǎng)時(shí)間等對PseudomonasfluorescensPGM37菌EPS分泌的影響。近年來，采礦、金屬冶煉、電鍍以及IT等行業(yè)會大量排放含Cu廢水，其中Cu2＋的含量普遍在幾十至上百 mg／L［16－17］，Cu污染問題亟待有效解決。因此，本文首先研究了不同生長因子對SRB菌分泌EPS的影響，繼而進(jìn)一步考察了不同生長因子作用下SRB菌分泌的EPS對Cu2＋的吸附性能。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

此菌株為硫酸鹽脫硫弧菌（Desulfovibrio desulfurican），是由本課題組從合肥市某污水處理廠底部厭氧發(fā)酵污泥中分離得到，鑒別號為：HQ022824.1。實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基是Starkey培養(yǎng)基，具體成分為：K2HPO40.5g，NH4Cl 1.0g，Na2SO40.5g，CaCl20.1g，MgSO42.0g，70%乳酸納5.0mL，蒸餾水1 000mL，抗壞血酸1%，pH＝7.0±0.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 生長因子對SRB菌分泌wEPS影響

pH 值、接種菌 體濃 度 （TS），w（F／M）和ρ（COD）／ρ（SO42－）是影響SRB生長代謝的重要生長因子。大量研究表明，pH值在6.5～8.0，接種菌體濃度在10%（本研究以TS的量表示接種濃度，在接種菌體濃度為10%時(shí)接種TS為45mg／L左右），加入乳酸鈉的質(zhì)量比在63.5～90g／g，ρ（COD）／ρ（SO42－）值在2.0～2.5之間時(shí)，SRB 的生 長 代 謝 最 佳［18－21］，但 是 相 關(guān)文 獻(xiàn) 并沒有對EPS的產(chǎn)生量進(jìn)行研究。因此根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合本株菌自身的生長狀況選取較寬泛的取值范圍，利用序批式實(shí)驗(yàn)研究不同pH值、接種菌體濃度（TS），F(xiàn)／M 和COD／SO42－值對SRB產(chǎn)EPS的影響。具體設(shè)計(jì)見表1所列。

表1 不同生長因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)在磨口錐形瓶中進(jìn)行，接種前在無菌條件下向培養(yǎng)基中充氮?dú)庖耘懦鯕?。接種后置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44h。反應(yīng)結(jié)束后，測量OD600、EPS含量；對于不同F(xiàn)／M實(shí)驗(yàn)，測定反應(yīng)前后的COD。

1.2.2 EPS對Cu2＋的吸附實(shí)驗(yàn)

分別取不同影響因子下SRB菌分泌的EPS 10mL置入透析袋中，再將透析袋放入含有40mg／L Cu2＋溶液的燒杯中透析24h，然后將透析袋置入蒸餾水中以去除透析袋內(nèi)游離的Cu2＋，反應(yīng)結(jié)束后測量EPS和透析液中的Cu2＋含量。整個(gè)吸附過程在pH＝5的條件下進(jìn)行以保證體系中的Cu以離子狀態(tài)存在。

1.3 分析方法

培養(yǎng)結(jié)束后將菌液于4℃、4 000r／min下離心15min，取上清液測定SO42－質(zhì)量濃度和COD質(zhì)量濃度；離心所得沉淀物用蒸餾水清洗后用加熱法提取EPS。首先將沉淀物于80℃水浴中加熱10min，然后在4 ℃、14 000r／min下離心15min，取上清液用0.22μm的纖維素膜過濾，將濾液置入3 500Da的半透膜中透析24h以獲得EPS樣品。

EPS中多糖采用蒽酮法，蛋白質(zhì)采用lowery法，核酸采用紫外分光光度法測定。重金屬Cu2＋使用TAS－986型原子吸收分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）測定；SO42－采用鉻酸鋇分光光度法測定；COD采用重鉻酸鉀法測定。EPS的紅外光譜采用傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 67，美國Thermo Nicolet公司）測量。紅外樣品的制備方法采用吸附壓片法［22］。先將KBr溶解于EPS溶液中，再緩慢蒸發(fā)使其析出，此時(shí)EPS吸附在KBr上，再將析出物加KBr研磨后壓片，即可上機(jī)測試。掃描波長為800～4 000cm－1。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 pH對SRB分泌EPS的影響

pH值對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附如圖1所示。從圖1a中可以看出，當(dāng)初始溶液為中性的條件下EPS的產(chǎn)率最高；當(dāng)pH上升時(shí)，EPS產(chǎn)率略微下降；在pH＜7時(shí)，EPS產(chǎn)率下降趨勢明顯；當(dāng)pH＜5時(shí)，由于SRB死亡，無EPS產(chǎn)生（圖中未顯示）。這是由于在酸性條件下，羧基、多聚糖酚類和蛋白質(zhì)肽鍵消失；而在堿性的條件下，這些基團(tuán)基本上不受影響［23］。因此，在酸性條件下，EPS隨著pH值的上升而上升；在堿性條件下EPS隨pH值變化并不明顯。

不同初始pH值下SRB產(chǎn)生的EPS對Cu2＋的吸附效果如圖1b所示，在接近中性的條件下產(chǎn)生的EPS對Cu2＋的吸附性能較強(qiáng)，并于pH＝8時(shí)產(chǎn)生的EPS對Cu2＋的吸附效果最佳。在所研究的pH值范圍內(nèi)，當(dāng)初始pH值為5或9時(shí)培養(yǎng)的SRB產(chǎn)生的EPS對Cu2＋的吸附性能不佳。這可能是因?yàn)樵诘偷膒H值下溶液中的H＋會和羥基等基團(tuán)結(jié)合，而pH值高時(shí)溶液中OH－會與羧基等基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，因此溶液中Cu2＋要通過競爭作用才能與這些基團(tuán)結(jié)合［24］，從而導(dǎo)致吸附量降低。

圖1 pH值對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附

2.2 接種TS對SRB分泌EPS的影響

接種TS對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附如圖2所示。

從圖2a中可以看出隨著初始接種TS的增加，EPS的產(chǎn)率呈不規(guī)則變化?？傮w來說在低（ρ（TS）＝18.2mg／L）和高（ρ（TS）＝182mg／L）的初始接種TS情況下EPS產(chǎn)率較高。微生物在生長過程中分泌EPS附著在細(xì)胞周圍，就像一個(gè)細(xì)胞壁外的類凝膠層，以延遲擴(kuò)散的方式延遲或者防止毒性物質(zhì)和微生物接觸或者用化學(xué)方法減少毒性物質(zhì)的傷害［25］。在底物質(zhì)量濃度不變的情況下，高的接種量意味著高的細(xì)菌本底值，底物消耗加快，細(xì)菌更早地進(jìn)入衰亡期，在此階段會伴有較多細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)的溶出和有毒物質(zhì)積累［26］。雖然在衰亡期釋放到溶液中的EPS含量較多［27］，但是在高的接種量下由于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出與有毒物質(zhì)刺激EPS的含量仍較高。在低的接種量下由于底物質(zhì)量濃度相同，微生物有更大的生長空間，相比于其他接種量下此時(shí)SRB活性較高，因而釋放到溶液中的EPS更少［27］。所以在低的接種量下EPS的含量也較高。不同接種TS條件下SRB分泌的EPS對Cu2＋的吸附如圖2b所示，接種質(zhì)量濃度過高或過低的條件下產(chǎn)生的EPS均不利于對Cu2＋的吸附，總體來說，接種TS處于36.4～136.5mg／L之間時(shí)細(xì)菌產(chǎn)生的EPS相比于高和低的接種質(zhì)量濃度下產(chǎn)生的EPS對Cu2＋具有更強(qiáng)的吸附能力。在高的接種量下由于SRB處于不利的生長條件下，產(chǎn)生的EPS會抵抗外部不利因素。由此推測，EPS的吸附位點(diǎn)會在此過程中遭到破壞，造成吸附量的降低；低的接種量下細(xì)菌適應(yīng)期延長，雖然會分泌大量的EPS，但是EPS的吸附性能和SRB的活性均保持在較低水平。

圖2 接種TS對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附

2.3 初始F／M對SRB分泌EPS的影響

初始F／M對SRB分泌EPS的影響 及EPS對Cu2＋的吸附如圖3所示，其中F／M為COD／TS。

圖3 初始F／M對SRB分泌EPS的影響 及EPS對Cu2＋的吸附

從圖3a中可以看出當(dāng)w（F／M）從18.1上升到136.0時(shí)，EPS的產(chǎn)率出現(xiàn)明顯降低；當(dāng)w（F／M）超過136.0后，EPS的產(chǎn)率基本上不發(fā)生變化。這表明在微生物長勢不佳的情況下，SRB分泌的EPS較多。因?yàn)樵诮臃N量不變的情況下，初始COD的質(zhì)量濃度越低，細(xì)菌可利用的營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，細(xì)菌更早地進(jìn)入衰亡期，有毒物質(zhì)滋生，因此會刺激SRB菌分泌更多的EPS保護(hù)細(xì)胞［28］。當(dāng)初始COD質(zhì)量濃度增加到一定程度后，SRB有足夠的碳源，因此分泌的EPS無明顯變化。

不同w（F／M）下SRB分泌的EPS對Cu2＋的吸附性能如圖3b所示。當(dāng)初始w（F／M）在0～90.7范圍內(nèi)，從SRB菌中提取的EPS對Cu2＋的吸附效果顯著，在低的C源下，雖然會分泌大量的EPS，但是吸附Cu2＋的效果不佳，推測EPS中吸附位點(diǎn)可能會被生長過程中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)破壞，導(dǎo)致其吸附量較低；而隨著C源的增加，有毒物質(zhì)積累緩慢，EPS的吸附位點(diǎn)增多，吸附Cu2＋的量也隨之增多；當(dāng)C源的含量超過一定值時(shí)，SRB菌生長穩(wěn)定，在沒有不利條件的刺激下細(xì)菌分泌的EPS量相對較少且組成成分變化不大，從而吸附Cu2＋的量也減少且無明顯差異。

2.4 不同初始ρ（COD）／ρ（SO42－）的影響

不同ρ（COD）／ρ（SO42－）對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附如圖4所示。

如圖4a所示，ρ（SO42－）對SRB分泌EPS的影響顯著。在ρ（COD）／ρ（SO42－）為3∶0.3條件下，SRB沒有充分的電子受體，生長條件惡劣，會分泌較多的EPS來保護(hù)細(xì)胞，此時(shí)由于細(xì)菌處于衰亡期，釋放到溶液中的相對較多，所以此時(shí)EPS含量并未達(dá)到最大；當(dāng)ρ（COD）／ρ（SO42－）為3∶1.0時(shí)，EPS分泌量達(dá)到最大。當(dāng)超過這一比值后，體系中有足夠的SO42－供SRB生長利用，細(xì)菌在生長過程受到的外界刺激弱，所以產(chǎn)生的EPS的含量降低。

圖4b所示的是不同SO42－質(zhì)量濃度下SRB產(chǎn)生的EPS對Cu2＋的吸附性能。在不同初始SO42－質(zhì)量濃度下產(chǎn)生的EPS對Cu2＋的吸附量具有明顯差異，在研究的范圍內(nèi)，隨著初始SO42－質(zhì)量濃度升高，SRB菌產(chǎn)生的EPS對Cu2＋的吸附能力逐漸降低。

圖4 不同ρ（COD）／ρ（SO42－）對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附

2.5 FTIR圖譜分析

吸附前后EPS的紅外光譜圖如圖5所示，掃描波數(shù)為800～4 000cm－1。3 412cm－1處為—NH2伸縮振動峰；3 479cm－1處為—NH伸縮振動峰，3 555cm－1為—OH伸縮振動產(chǎn)生的峰；1 655cm－1處是C＝O和C—N伸縮振動峰（酰胺Ⅰ帶）；1 378cm－1處是多糖羧基中C＝O對稱振動；1 109cm－1處C—O伸縮振動峰，1 034cm－1處是P＝O振動峰為核酸的磷酸二酯骨架或C—OH振動峰為磷酸化的蛋白質(zhì)；991cm－1處為C—O—C振動峰。EPS的FTIR光譜顯示其含有眾多蛋白質(zhì)和多糖的官能團(tuán)，進(jìn)一步證實(shí)了其生物化學(xué)組成［6，29，30］。

圖5 吸附前后EPS的FTIR圖

與吸附前相比，吸附Cu2＋之后的FTIR峰在峰位置及強(qiáng)度上均發(fā)生改變。表征蛋白質(zhì)的特征峰：3 479cm－1處—NH2峰消失，表明—NH2與Cu2＋發(fā)生配位作用；3 412cm－1處—NH峰偏移到3 420cm－1處，1 613cm－1處C＝O和C—N峰偏移到1 655cm－1處，1 109cm－1處C—O峰偏移到1 092cm－1處，并伴有峰強(qiáng)度的改變。3 555cm－1處—OH、1 378cm－1處C＝O表征多糖的特征峰、1 034cm－1處表征核酸的特征峰未發(fā)生明顯偏移，只是峰強(qiáng)度發(fā)生改變。這些結(jié)果表明在SRB菌EPS對Cu2＋吸附過程中，蛋白質(zhì)的作用要強(qiáng)于多糖。

3 結(jié) 論

（1）在pH＝7、初始接種 TS為182mg／L、w（F／M）為18.1和ρ（COD）／ρ（SO42－）為3∶1.0的條件下硫酸鹽分泌的EPS最多。

（2）在pH＝8、初始接種TS為136.5mg／L、w（F／M）為45.3和ρ（COD）／ρ（SO42－）為3∶0.3的條件下，對硫酸鹽還原菌進(jìn)行培養(yǎng)獲得的EPS對Cu2＋的吸附性能最佳。

（3）EPS對Cu2＋吸附過程中，蛋白質(zhì)作用強(qiáng)于多糖。

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