馬曉燕 曹定睿 蘇丹丹 連梓敏 王泓源

舒芬太尼對肝癌大鼠肝細胞凋亡的影響

馬曉燕 曹定睿 蘇丹丹 連梓敏 王泓源

探討舒芬太尼對肝癌大鼠肝細胞凋亡及Bax、Bcl-2的影響。48只wistar大鼠隨機分為兩個大組：對照組(C組, n=24), 舒芬太尼組(S組, n=24)。各大組根據(jù)給鹽水或舒芬太尼后1, 3, 6 h處死動物分三個時相, 記為C1, C3, C6; S1, S3和S6六個組。實驗結(jié)束后立即取含有肝癌組織的肝葉做標(biāo)本。光鏡觀察組織及細胞形態(tài)變化, 確定肝癌發(fā)生。免疫組化法檢測肝組織Bcl-2、Bax蛋白, 末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)法檢測肝細胞凋亡指數(shù)(AI)。舒芬太尼可以下調(diào)肝癌大鼠肝組織Bax蛋白表達, 上調(diào)Bcl-2蛋白表達, 使肝細胞凋亡減輕, 對肝癌大鼠肝細胞有一定的保護作用。

舒芬太尼； 肝癌； 肝細胞凋亡； Bax； Bcl-2

惡性腫瘤是目前世界范圍內(nèi)的多發(fā)病和常見病, 其發(fā)病率和死亡率居高不下。外科手術(shù)是早中期癌癥患者的主要治療方式。在圍手術(shù)期和術(shù)后鎮(zhèn)痛以及晚期癌癥患者的鎮(zhèn)痛治療中阿片類鎮(zhèn)痛藥物的使用起到了舉足輕重的作用。舒芬太尼是一種新合成的μ阿片受體激動藥［1］, 鎮(zhèn)痛作用強、維持時間長, 副作用較嗎啡和芬太尼少而廣泛應(yīng)用于各類手術(shù)的麻醉及術(shù)后鎮(zhèn)痛。本研究通過建立Wistar大鼠肝癌模型, 檢測肝組織Bax、Bcl-2蛋白的變化及細胞凋亡率來探討舒芬太尼對肝癌大鼠肝細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象及分組 成年雌性Wistar大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)生理動物室提供) 48只, 體重 180~230g , 隨機分為兩個大組, 對照組(C組), 舒芬太尼組(S組)。各大組根據(jù)給藥后1, 3, 6 h 3個時相, 分為C1, C3, C6；S1, S3和S6六個小組。

1.2實驗材料主要試劑 Bax兔抗鼠多克隆抗體, Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體, 和DAB顯色試劑盒, 非生物素檢測試劑盒,原位細胞凋亡檢測(TUNEL)。主要藥物：舒芬太尼注射液,咪達唑侖注射液, 氯胺酮注射液, 0.9%氯化鈉注射液。

1.3Wistar大鼠肝癌模型制備 參考邵成偉等［2］采用直接注射法制備大鼠肝癌模型：選取Wistar雌性大鼠 48只, 體重 180~230 g; 另取剛斷奶Wistar雌性大鼠 2 只, 體重 50~70 g, 供腫瘤傳代使用。腫瘤細胞經(jīng)過復(fù)蘇, 注入剛斷奶大鼠腹腔,等到癌性腹水生成。從傳代的大鼠腹腔抽取癌性腹水15 ml,將其置于離心機內(nèi)離心, 轉(zhuǎn)速2000次/min, 時間2 min。完成離心工作后, 除去最上面較清亮的腹水, 保留下層半液態(tài)物, 抽入到3個1 ml注射器內(nèi)備用。用橡皮筋把麻醉后的雌性大鼠用仰臥式固定在實驗臺上, 沿腹正中剪去體毛, 消毒后, 沿腹白線逐層開腹, 輕壓大鼠胸腔, 肝臟便跳出腹腔, 選體積最大的肝葉種植癌細胞。術(shù)者左手固定肝臟, 右手拿著裝有離心后癌性腹水的注射器, 針尖與水平面成30°, 刺入肝臟約1 cm左右, 注入濃縮的癌性腹水約0.05 ml。拔針后,立即用棉簽按壓穿刺點約3~5 min, 無活動性出血后輕送肝臟還納腹腔, 共接種48只。接種完畢后將大鼠放回籠中飼養(yǎng)10 d, 大鼠肝臟便可形成0.8~1 cm的腫瘤。

1.4藥物干預(yù) 將48只造模10 d后的Wisar大鼠依次腹腔麻醉后放置在木板上, S組給予舒芬太尼5 μg/kg 10 min內(nèi)靜脈泵入, C組10 min內(nèi)靜脈泵入等容積的生理鹽水, 給藥完畢后登記好放入籠中。

1.5標(biāo)本采集在經(jīng)尾靜脈輸注生理鹽水或舒芬太尼后的1, 3, 6 h斷勁處死大鼠, 迅速摘取含有腫瘤的肝葉, 放入10%甲醛, 用于制作病理切片和免疫組織化學(xué)切片。

1.6觀察指標(biāo)及檢測方法①組織學(xué)觀察：將固定24 h后的肝組織常規(guī)包埋, 切片, 蘇木素-伊紅染色, 光鏡下觀察。②肝組織 Bcl-2、Bax表達的測定：采用二步免疫組織化學(xué)法檢測Bcl-2、Bax 蛋白的表達。顯微鏡下, 肝細胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為 Bcl-2、Bax 陽性表達, 利用Apero組織切片掃描系統(tǒng)計算平均光密度值(OD)進行定量分析。③原位細胞凋亡檢測：用 TUNEL 法進行原位細胞的凋亡檢測, 凋亡的陽性細胞核被染成棕黃色, 未凋亡的細胞核為深藍色。每張切片隨機選取5個四百倍視野, 計數(shù)凋亡陽性細胞, 以凋亡指數(shù)(AI)表示各組肝組織凋亡情況。

2 討論

細胞凋亡是體內(nèi)外因素觸發(fā)的、受機體嚴(yán)密調(diào)控的細胞程序性死亡, 它呈現(xiàn)出獨特的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點, 是機體維持個體內(nèi)穩(wěn)態(tài)恒定的重要機制之一［3］。當(dāng)腫瘤細胞浸潤肝組織時, 肝細胞由于鈣超載和氧化應(yīng)激等多種誘因, 使線粒體內(nèi)膜通透性改變, 跨膜電位下降, 能量合成降低從而發(fā)生細胞凋亡.這次試驗是通過建立Wistar大鼠肝癌模型, 利用免疫組化和 TUNEL 試驗檢測 Bcl-2、Bax 蛋白表達和AI值,實驗結(jié)果表明, 給予舒芬太尼后C組各小組與S1組比較無統(tǒng)計學(xué)差異, 隨著時間的延長, 與C組比較, S3, S6組肝組織Bax蛋白表達降低, Bcl-2蛋白增加, Bax/Bcl-2比值降低, AI值降低, 說明舒芬太尼可以通過下調(diào)Bax蛋白, 上調(diào)Bcl-2蛋白的表達來抑制盰細胞的凋亡, 證實舒芬太尼對肝癌大鼠肝細胞有一定的保護作用［4］。C組各小組與S1組比較無統(tǒng)計學(xué)差異, 可能是由于舒芬太尼作用時間短, 藥效未完全發(fā)揮作用, 其作用與時間具有相關(guān)性。舒芬太尼的保護作用可能是由于抑制了腫瘤細胞的發(fā)生, 增殖, 轉(zhuǎn)移；也可能是由于抑制了腫瘤細胞誘發(fā)的炎癥反應(yīng)對肝細胞的損傷, 舒芬太尼對肝癌大鼠肝細胞保護作用機制, 劑量、時間相關(guān)性以及是否具有封頂效應(yīng)有待進一步探討。

［1］ Junttila EK, Karjalainen PK, Ohtonen PP, et al.A comparison of paracervical block with single- shot spinal for labour analgesia in multiparous women: a randomised controlled trial.Int J ObstetAnesth, 2009,18(1):15-21.

［2］ 邵成偉, 田建明, 王培軍, 等.兩種大鼠肝癌模型制作方法的比較研究臨床放射學(xué)雜志2002, 21(12):985-987

［3］ Bardales RH, Xie SS, Schaefer RF, et al.Apoptosis is a major pathway responsible f or t he resolution of typeⅡpneumocytes in acute lung injury.Am J Pathol, 1996(149): 845- 852.

［4］ Gaveriaux-Ruff C, Matthes HW, Peluso J, et al.Abolition ofmorphine-immunosuppression in mice lacking themu-opioid receptor gene.Proc.Natl Acad Sci, 1998(95):6326~6330

0300011 太原, 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科(馬曉燕 曹定睿 連梓敏 王泓源)；山西省長治市人民醫(yī)院(蘇丹丹)

曹定睿 E-mail：2355429529@qq.com