崔志強(qiáng)宋魯杰綜述 盧洪凱王永傳審校

1. 山東省濰坊市中醫(yī)院泌尿外科（濰坊 261041）;

2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科; 3.濰坊市人民醫(yī)院泌尿外科

·綜 述·

損傷性ED動(dòng)物模型研究進(jìn)展

崔志強(qiáng)1宋魯杰2綜述 盧洪凱3王永傳1審校

1. 山東省濰坊市中醫(yī)院泌尿外科（濰坊 261041）;

2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科; 3.濰坊市人民醫(yī)院泌尿外科

近年來(lái)，前列腺根治術(shù)（RP）和根治性膀胱切除術(shù)、外傷所致的骨盆骨折和尿道斷裂（pelvic fracture urethral disruption, PFUD）以及骨盆和后尿道手術(shù)的患者不斷增多，其可對(duì)CN產(chǎn)生不同方式及程度的損傷，ED作為它們并發(fā)之一，發(fā)病率也不斷增加，國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道保留單側(cè)和雙側(cè)神經(jīng)血管束（NVB）的RP后ED發(fā)病率分別為76%和53%[1]，PFUD患者ED發(fā)生率高達(dá)42%[2]，后尿道端端吻合術(shù)后ED的發(fā)生率為56%[3]。ED可對(duì)男性及其配偶的身體和心理健康產(chǎn)生重要的影響[4]，為此，許多科學(xué)家參與了對(duì)ED的研究。1863年，Eckhard[5]首次報(bào)道了盆腔神經(jīng)在勃起功能中的重要性，提出了ED的基本概念，并增加了我們對(duì)ED病理生理學(xué)的認(rèn)識(shí)[6]。通過對(duì)調(diào)節(jié)勃起的神經(jīng)生理學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)許多激素和神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)陰莖勃起起到重要作用[7]。雖然人類性功能復(fù)雜的屬性不可能被完全復(fù)制，但是動(dòng)物模型是研究和評(píng)估ED的重要方式。現(xiàn)將損傷性ED動(dòng)物模型的相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

一、動(dòng)物的選擇

雖然狗、猴子、貓和兔子等大動(dòng)物在早期（1960-1990）常被作為研究勃起功能的模型，但是嚙齒類動(dòng)物已在很大程度上取代這些大的動(dòng)物作為主要的動(dòng)物模型，主要有以下幾個(gè)原因：第一是實(shí)驗(yàn)費(fèi)用方面，嚙齒類動(dòng)物比大動(dòng)物更經(jīng)濟(jì)；第二是嚙齒類動(dòng)物模型已被充分證明具有和人類相似的形態(tài)和功能；第三是手術(shù)操作和CN解剖方面，嚙齒動(dòng)物模型很更簡(jiǎn)單、容易；第四是由于嚙齒類動(dòng)物壽命較短，在此期間內(nèi)，可以通過檢測(cè)動(dòng)物的生物反應(yīng)評(píng)估疾病狀態(tài)和治療性干預(yù)的效果[8]。雖然嚙齒類動(dòng)物模型在ED研究中有許多優(yōu)點(diǎn)，但是它不能代表人類復(fù)雜的性行為和疾病。因?yàn)閲X類動(dòng)物的壽命比較短，所以不允許長(zhǎng)期研究不同ED模型類型。雄性大鼠的性反應(yīng)主要依賴于嗅覺刺激，而人類更多地依賴于視覺和聽覺刺激。此外，嚙齒類動(dòng)物不能完全理解陰莖勃起反應(yīng)的含義，電刺激和成功插入雌性大鼠陰道分別引起的陰莖勃起也是有所不同的，而事實(shí)上，嚙齒類動(dòng)物通過交配和電刺激引起的勃起反應(yīng)與人類的也是有區(qū)別的。盡管如此，嚙齒類動(dòng)物模型對(duì)人類仍具有較高的可預(yù)測(cè)性。鑒于上述種種原因，嚙齒類動(dòng)物目前被作為ED研究的最常用的動(dòng)物模型。

二、勃起反應(yīng)的評(píng)價(jià)方法

海綿體內(nèi)壓（ICP）檢測(cè)是陰莖勃起研究的重要方法，電刺激麻醉狀態(tài)大鼠的周圍神經(jīng)，并測(cè)量其ICP的變化。阿樸嗎啡（APO）具有誘發(fā)勃起的藥理作用，雄性大鼠注射APO后可引起陰莖勃起反應(yīng)[9]。Quinlan等[10]對(duì)CN損傷動(dòng)物模型進(jìn)一步研究后提出，通過測(cè)量ICP和平均動(dòng)脈壓（MAP）的變化來(lái)檢測(cè)CN損傷對(duì)勃起反應(yīng)的影響。動(dòng)態(tài)海綿體造影和陰莖海綿體測(cè)壓提供了海綿體平滑肌功能評(píng)價(jià)的指標(biāo)[11]。電刺激或化學(xué)刺激特定的大腦區(qū)域也可以引起陰莖勃起，內(nèi)側(cè)視前區(qū)和下丘腦室旁為研究調(diào)節(jié)陰莖勃起行為的中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供了更高級(jí)的神經(jīng)中心?？诜?、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)和海綿體等不同的給藥途徑已被用于研究它們對(duì)陰莖勃起的影響。

隨著蛋白質(zhì)標(biāo)記、免疫組化和Western blot分析等先進(jìn)技術(shù)的發(fā)展，改進(jìn)了對(duì)ED功能和形態(tài)學(xué)的評(píng)估，并增加了對(duì)ED病理生理學(xué)的理解[11-13]。動(dòng)物模型和人類的海綿體組織通過原代細(xì)胞培養(yǎng)，可以增加我們對(duì)勃起功能細(xì)胞機(jī)制的了解[14]。在體外實(shí)驗(yàn)中，利用重組載體敲除（KO）蛋白質(zhì)或酶，以及利用間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行自體細(xì)胞培養(yǎng)，也增加對(duì)病理生理學(xué)的認(rèn)識(shí)[15]。

三、損傷模型的分類

（一）CN損傷模型

Walsh和Donker[16]首次報(bào)道了骨盆手術(shù)對(duì)勃起神經(jīng)通路的影響，前列腺癌根治術(shù)（RP）可以導(dǎo)致ED。有研究表明，RP后性功能恢復(fù)情況與術(shù)前有效的保護(hù)神經(jīng)血管束有密切的聯(lián)系，盡管技術(shù)不斷的創(chuàng)新和進(jìn)步，但是CN在保留神經(jīng)（NS）的RP中仍然不可避免的被暴露和損傷，并導(dǎo)致ED。由于這個(gè)原因，許多科學(xué)家已經(jīng)建立了多種CN損傷的動(dòng)物模型，每種CN損傷模型都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)需要選擇。

CN損傷模型的類型 Quinlan等[10]第一次利用嚙齒類動(dòng)物模型研究陰莖勃起，利用電刺激誘導(dǎo)并測(cè)量大鼠的最大ICP，并建立了CN損傷模型的各種技術(shù)[17]。牽拉、擠壓、切斷、冷凍和切除CN等不同CN損傷方式已在各種動(dòng)物模型中被廣泛應(yīng)用[18]。

CN擠壓模型可由止血鉗、動(dòng)脈夾等外科器械引起，造成CN機(jī)械壓迫，擠壓時(shí)間為15s～2min[19,20]。在CN擠壓模型中，利用止血鉗擠壓CN 2min，發(fā)現(xiàn)ICP降低，盆大神經(jīng)節(jié)（MPG）和CN中的神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）陽(yáng)性神經(jīng)纖維的含量顯著減少[19]；Sezen等[20]在CN損傷研究中也發(fā)現(xiàn)了ICP降低和陰莖背神經(jīng)中nNOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維的含量減少。

冷凍是另一種CN損傷方式，利用干冰冷凍損傷CN，早期出現(xiàn)ICP降低和nNOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維的含量減少，但是3個(gè)月后陰莖血流動(dòng)力學(xué)和組織學(xué)恢復(fù)正常[21]。由于CN冷凍損傷保持相對(duì)完好的CN鞘，它在損傷的CN兩端提供了一個(gè)潛在的神經(jīng)軸突再生的神經(jīng)通路，從而恢復(fù)勃起功能。

游離性CN損傷的動(dòng)物模型，從MPG到前列腺尖部游離CN，此過程中沒有CN擠壓和切斷，雖然早期發(fā)現(xiàn)ICP和nNOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維的含量減少，但是8周后它們明顯恢復(fù)[22]，這種動(dòng)物模型為我們解釋了CN游離導(dǎo)致CN損傷性ED的機(jī)制。

最近，朱建強(qiáng)等[23]在電凝損傷CN動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，ICP/MAP下降，陰莖背神經(jīng)中神經(jīng)絲蛋白的含量減少，并且海綿體組織纖維化，術(shù)后第1周電刺激CN后陰莖無(wú)勃起反應(yīng)，ICP處于基線水平，雖然4周后ICP有了一定程度的提高，但仍顯著低于對(duì)照組。電凝損傷可以產(chǎn)生局部高溫，造成蛋白質(zhì)變性、組織缺血及炎癥反應(yīng)，對(duì)CN產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致ED。

CN切斷和切除是比較嚴(yán)重的CN損傷模型，CN切斷損傷使用剪刀直接切斷CN[24]，而CN切除損傷需要切除一段CN[25]，從理論上講，CN切除比CN切斷對(duì)勃起功能的影響更嚴(yán)重。CN鞘連續(xù)性中斷，缺乏神經(jīng)再生軸突到達(dá)靶組織的神經(jīng)通路，并導(dǎo)致不可逆的損害。此外，CN鞘損傷還可以導(dǎo)致陰莖平滑肌細(xì)胞凋亡，并引起靜脈閉塞性陰莖勃起功能障礙。

1. 單側(cè)CN損傷：Carrier等[26]發(fā)現(xiàn)單側(cè)CN損傷與雙側(cè)CN損傷相比，6個(gè)月后前者nNOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維的含量更多，ICP數(shù)值更高，勃起反應(yīng)更好。連續(xù)的神經(jīng)纖維可以合成神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并維持其支配器官的結(jié)構(gòu)和功能[27]，在CN擠壓和CN冷凍動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)CN損傷后軸突再生的現(xiàn)象[20,21]。然而，單側(cè)CN切斷模型中對(duì)側(cè)CN未損傷，可能會(huì)對(duì)損傷側(cè)神經(jīng)的再生和恢復(fù)產(chǎn)生影響，并混淆實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2. 雙側(cè)CN損傷：相比之下，雙側(cè)CN切斷后陰莖勃起功能迅速喪失，并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間勃起功能完全喪失[10]。Zhang等[28]在雙側(cè)CN損傷模型中發(fā)現(xiàn)，nNOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維的含量在第3周時(shí)顯著減少，6月后神經(jīng)仍未出現(xiàn)再生。CN切斷2周后海綿體平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組織學(xué)表現(xiàn)是顯而易見的[29]，可能是由于調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞凋亡的sonic hedgehog（SHH）減少造成的[30]。SHH被抑制之后陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞凋亡增加12倍，SHH治療CN損傷的動(dòng)物模型后，海綿體平滑肌未出現(xiàn)明顯損傷性變化。因此，CN切斷引起的ED，可能是由于神經(jīng)破壞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌功能障礙造成的。

Jin等[31]在CN損傷導(dǎo)致ED的動(dòng)物模型中，進(jìn)一步說明了陰莖血流動(dòng)力學(xué)紊亂和海綿體超微結(jié)構(gòu)改變，與對(duì)照組比較，ICP明顯降低，纖維化因子表達(dá)增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞和磷酸化Smad2陽(yáng)性的海綿體內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞數(shù)目增加，CN擠壓造成勃起反應(yīng)持續(xù)4W減弱，CN切斷引起的ED持續(xù)12W。

3. 轉(zhuǎn)基因CN損傷模型：NOS和一氧化氮（NO）在陰莖勃起過程中起到重要作用。目前，研究發(fā)現(xiàn)NO是激活NOS的重要因素，nNOS和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）對(duì)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）具有重要作用。有研究認(rèn)為nNOS通過激活中樞和外周系統(tǒng)，在勃起反應(yīng)的起始階段起到重要作用，而eNOS促進(jìn)血液流入海綿體竇，引起陰莖勃起[32]。基因工程小鼠缺乏nNOS和eNOS，ICP明顯降低，西地那非對(duì)nNOS基因KO小鼠增加勃起反應(yīng)的作用減弱[33]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)自然勃起數(shù)目增加，并且膠原蛋白和彈性蛋白的表達(dá)也增加[34]。TNF-α是一個(gè)促炎細(xì)胞因子，可以抑制eNOS表達(dá)，TNF-α基因KO小鼠的eNOS表達(dá)增強(qiáng)，有利于陰莖勃起。

最近研究認(rèn)為，iNOS具有防止組織纖維化和平滑肌細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性防御機(jī)制。Ferrini等[35]發(fā)現(xiàn)iNOS可以降低體內(nèi)組織的纖維化，并維持NO的藥理學(xué)水平。在iNOS基因KO小鼠中，體內(nèi)海綿體平滑肌/膠原的比例和平滑肌含量減少，這與ED動(dòng)物模型中的結(jié)果一致。

（二）動(dòng)脈結(jié)扎模型

陰莖動(dòng)脈供血不足已被證明是ED的常見原因。髂內(nèi)-陰部?jī)?nèi)-陰莖海綿體動(dòng)脈系的動(dòng)脈粥樣硬化或創(chuàng)傷性動(dòng)脈閉塞性疾病可以導(dǎo)致陰莖血流灌注壓降低，改變陰莖血流動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致ED的發(fā)生、發(fā)展。有研究表明，ED的出現(xiàn)早于冠心病[36]。結(jié)扎大鼠雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈可以直接引起ICP降低，但1個(gè)月后勃起明顯恢復(fù)[37]。免疫組化染色顯示陰莖背神經(jīng)和海綿體神經(jīng)中nNOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維的含量減少，而聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）提示初期的TGFβ-1表達(dá)上調(diào)。與其他器官缺血性變化一樣，也會(huì)出現(xiàn)成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞損傷、脂肪變性、膠原沉積和血竇塌陷等典型變化[38]。de Young等[39]也有類似的報(bào)道，海綿體組織中蛋白質(zhì)表達(dá)和血管內(nèi)皮的完整性發(fā)生改變，平滑肌纖維和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)減少，CN中nNOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維的含量也顯著減少。

急性?shī)A閉單側(cè)陰部?jī)?nèi)動(dòng)脈或陰莖動(dòng)脈可引起對(duì)側(cè)陰部?jī)?nèi)動(dòng)脈血流代償性增加，只影響同側(cè)ICP，但雙側(cè)夾閉陰部?jī)?nèi)動(dòng)脈引起雙側(cè)ICP顯著降低，嚴(yán)重影響勃起反應(yīng)[40]。然而慢性陰部?jī)?nèi)動(dòng)脈流入障礙對(duì)勃起功能影響較小，可能是由于陰莖周圍側(cè)枝循環(huán)建立緩解了這種缺血的改變。結(jié)扎髂內(nèi)動(dòng)脈后海綿體內(nèi)注射VEGF，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)肥大和增生，血管生成作用顯著增強(qiáng)，可以促進(jìn)勃起功能的恢復(fù)[41]。

（三）脊髓損傷模型

與CN損傷模型相比，脊髓損傷（SCI）和其他神經(jīng)系統(tǒng)損傷的ED動(dòng)物模型報(bào)道比較少。Allard和Edmunds等[42]在SCI動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，可以出現(xiàn)類似射精節(jié)律性的球海綿體肌和陰莖勃起收縮。脊髓橫斷比未受損傷脊髓的勃起反應(yīng)更強(qiáng)，并且肌電圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)球海綿體肌反射增強(qiáng)。Temeltas等[43]和Rivas等[44]在SCI模型中也發(fā)現(xiàn)了ICP的顯著增高。

四、結(jié)語(yǔ)

各種動(dòng)物模型的開發(fā)和建立已在ED領(lǐng)域取得顯著進(jìn)步。通過對(duì)勃起生理和再生醫(yī)學(xué)的研究，使我們對(duì)人類勃起功能障礙有了深刻的了解，也增加了對(duì)導(dǎo)致ED的病理生理學(xué)的理解，并可用于探索和測(cè)試新的治療ED的藥物和手術(shù)方式的效果。

雖然使用嚙齒類動(dòng)物模型研究ED仍將是較為理想的動(dòng)物模型選擇，但是我們需要認(rèn)識(shí)到，嚙齒類動(dòng)物的年齡、種類和品系可能會(huì)影響和干擾藥物的作用，從而對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。開發(fā)更加符合人類病理生理學(xué)的損傷性ED動(dòng)物模型將成為推動(dòng)ED治療研究的重要工具。

致謝：本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30901489）; 山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2011GGH21813）

模型,動(dòng)物; 勃起功能障礙

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（2013-11-18收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.019

R 698.1