張 宇綜述，張 兵審校

腦卒中已成為世界上導致死亡和神經(jīng)功能障礙的主要原因，嚴重危害人類健康。目前認為，缺血性腦組織損傷是由多種因素參與的復雜病理過程，其發(fā)病機制涉及腦組織能量代謝紊亂、興奮性氨基酸中毒、氧化應激損傷、炎癥反應等多個環(huán)節(jié)。目前最主要的治療措施是溶栓血運重建，矛盾的是，這會引起更嚴重的缺血-再灌注損傷。越來越多的證據(jù)證明刺激內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的表達將會是治療腦卒中的主要措施。其中以核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)為核心的Nrf2-Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)信號通路被認為是一種新型的抗氧化信號通路，對維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)起重要的作用，其調(diào)控的一大批下游分子具有抗氧化應激、調(diào)節(jié)炎癥損傷、抗細胞凋亡、緩解鈣離子超載等多重功能。本文我們重點闡述Nrf2-Keap1 在腦卒中中的神經(jīng)保護作用及其機制。

1 Nrf2-Keap1 信號通路分子基礎(chǔ)

1.1 Nrf2 的基本結(jié)構(gòu) Moi 等［1］最初發(fā)現(xiàn)Nrf2 是一種分子量為66000 的蛋白質(zhì)，屬于CNC-bZIP(cap‘n’collar subfamily of basic region-leucine zipper)，即CNC 亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族。目前為止，該家族已被證實包括6 個成員:NF-F2、Nrf1、Nrf2、Nrf3、Bach1 和Bach2。其中Nrf2 在機體中廣泛存在，對正常發(fā)育必不可少。Nrf2 分為6 個結(jié)構(gòu)域，分別被命名為Neh1-6［2，3］。(1)Neh1 區(qū):含有一個堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basic leucine zipper，bZip)，必須與細胞核內(nèi)小Maf 蛋白(包括MafG、MafK、MafF)結(jié)合形成異二聚體后才能識別并結(jié)合抗氧化反應元件(antioxidant responsive element，ARE)，啟動目標基因轉(zhuǎn)錄;(2)Neh2 區(qū):與胞漿蛋白Keap1 的Kelch 區(qū)相結(jié)合，負性調(diào)節(jié)Nrf2 的轉(zhuǎn)錄活性;(3)Neh3 區(qū):由位于Nrf2 C-末端的16 個氨基酸組成，與活化轉(zhuǎn)錄密切相關(guān);(4)Neh4 和Neh5 區(qū):是2 個獨立的激活區(qū)，富含酸性氨基酸殘基，通過與共激活劑(如CBF)結(jié)合發(fā)揮強大的轉(zhuǎn)錄活性;(5)Neh6 區(qū):富含絲氨酸殘基，已知功能甚少，可能與氧化應激細胞細胞核內(nèi)Nrf2 的降解有關(guān)。

1.2 Keap1 的基本結(jié)構(gòu) Keapl 為一種錨定于胞漿肌動蛋白細胞骨架上的多肽類物質(zhì)，其一級結(jié)構(gòu)含有624 個氨基酸，由NTR、BTB/POZ、IVR、DGR、和CTR5 個結(jié)構(gòu)域組成［4］。其中，BTB/POZ 區(qū)介導蛋白的二聚化作用;C-末端DGR 區(qū)包含6 個雙鏈甘氨酸重復片段，為Keapl 與Neh2 的結(jié)合位點，可抑制Nrf2 轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)發(fā)揮作用［5］;IVR 富含半胱氨酸殘基，對親電子劑或氧化物高度敏感。親電子物質(zhì)對半胱氨酸巰基修飾，可引起Keapl 的DGR 結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，從而導致與其結(jié)合的Nrf2 釋放。

2 Nrf2-Keap1 信號通路在腦中的調(diào)節(jié)機制

研究證實在氧自由基(ROS)及親電子物質(zhì)引起的內(nèi)源性和外源性應激反應中，Nrf2-Keap1 途徑在其中起主要的調(diào)節(jié)作用。在生理條件下，Keap1 與Nrf2 結(jié)合，通過泛素-蛋白酶體途徑(the ubiquitin-proteasome pathway)可促進Nrf2 降解。Nrf2 半衰期小于20 min，這種迅速的更新使其在細胞質(zhì)內(nèi)保持低水平狀態(tài)［6］。當機體受到氧化應激或親電子物質(zhì)的刺激時，Keap1 的半胱氨酸殘基被修飾，Nrf2 穩(wěn)定性降低，導致Nrf2 與Keap1 解離，進行核轉(zhuǎn)移，與一種小Maf 核蛋白形成異二聚體，并與下游一系列解毒或抗氧化酶基因啟動子序列的特定DNA 序列—順式作用元件ARE 結(jié)合，從而激活這些酶的表達。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要通過激活下游的血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)保護機體免受氧化活性物質(zhì)(如ROS、RNS)及有害物質(zhì)(如致癌物、藥物代謝活化產(chǎn)物等)的侵害［7］。其中與GSH 合成、代謝相關(guān)的酶類主要包括谷胱甘肽過氧化酶1(Gpx1)、谷胺酸半胱氨酸連接酶(GCL)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-s-transferase，GST)等。

3 Nrf2-Keap1 信號通路在腦卒中的表達

永久性腦局部缺血后，對鼠大腦中Nrf2 的mRNA 和蛋白表達揭示，其表達呈時間依賴性，在3 h 時開始增加，24 h達到高峰，48 h、72 h 時下降，下降的原因可能是Keap1 激活下游的通路引起Nrf2 降解有關(guān)。增加的Nrf2 位于神經(jīng)細胞、星形細胞的細胞核及細胞質(zhì)［8］。Tanaka 等人［9］研究表明，在大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型中，Nrf2、Keap1 及下游抗氧化蛋白-GSH、HO-1 在梗死周圍區(qū)域和梗死區(qū)的表達不同。細胞質(zhì)中Keap1 的表達在MCAO 后顯著下降，兩個區(qū)域中其水平在再灌后2 h～24 h 下降，72 h 后保持在低水平，相反Nrf2 在梗死周圍區(qū)域的表達于2 h 顯著增加，8 h 達到高峰，24 h～72 h 時下降，并且兩者的表達主要在神經(jīng)細胞而非膠質(zhì)細胞。梗死周圍區(qū)域Nrf2-Keap1 信號通路調(diào)控的下游抗氧化蛋白的水平缺血后24 h～72 h 才開始增加。值得注意的是，在缺血梗死區(qū)下游蛋白表達顯著減少，因此在梗死周圍區(qū)域，Nrf2-Keap1 通路的激活可能發(fā)揮更重要的內(nèi)源性神經(jīng)保護作用。這兩個研究的差異或許是因為所用模型的阻塞類型不同(永久性與短暫性)。在Nrf2-Keap1 信號通路表達的長期研究中進一步證實，Keap1 在8 h～3 d 的表達顯著減少，然而Nrf2 在ICH 后2 h 顯著增加，24 h 達到高峰，并且進一步發(fā)現(xiàn)ICH10 d 后，Keap1 和Nrf2 的水平幾乎達到正常水平，兩者表達部位與Tanaka 等人的研究一致。HO-1、GSH 和GST 基因水平在ICH 后早期階段就有不同程度的增加［10］。在采用原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞建立的短暫性缺血再灌注體外模型中證實，缺血再灌注0.5 h 后，Nrf2 由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核，隨著再灌注時間延長，胞漿和胞核內(nèi)Nrf2 均呈下降趨勢。再灌注8 h 后，Nrf2 不再下降，表達水平趨于穩(wěn)定［11］。以上研究中腦卒中后Nrf2 及Keap1 在神經(jīng)血管系統(tǒng)的分布部位不同，還需要進一步的實驗來明確。另有研究表明MCAO 后4 h～72 h，Nrf2 和HO-1 的蛋白在梗死周圍區(qū)域的微血管的表達上調(diào)，HO-1 優(yōu)先在血管周圍星形細胞表達［12］。

4 Nrf2-Keap1-HO-1 在腦卒中的作用

HO-1 是體內(nèi)血紅素降解的催化酶，分解血紅素生成Fe2+、一氧化碳(CO)和膽綠素，膽綠素又在膽綠素還原酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槟懠t素(BR)，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的器官保護作用［13］。HO-1 的具體作用機制還不明確，其可能通過以下兩種途徑起作用:(1)酶解可能引起氧化應激和炎癥反應的游離血紅素;(2)抗炎物質(zhì)BR、CO 的產(chǎn)生。許多研究已經(jīng)證明生理狀態(tài)下低水平的BR 通過清除ROS 發(fā)揮抗氧化應激的作用。HO-1 生成的CO 則參與凋亡、血管舒張和炎癥等的調(diào)節(jié)。

Wang 等人［14］發(fā)現(xiàn)將永久性腦缺血的小鼠，缺血后立即暴露于250 ppmCO18 h，梗阻面積顯著減少，并且Nrf2 與Keap1 的解離增加，促進Nrf2 核轉(zhuǎn)移，HO-1 的表達也隨之增加。而在Nrf2 基因敲除的小鼠中，這種保護作用消失。大鼠MCAO 模型研究證實，姜黃素［8］能夠激活Nrf2 通路引起Nrf2表達的增加，同時出現(xiàn)梗死體積縮小、腦水腫減輕和神經(jīng)功能改善。上述作用可能是通過上調(diào)Nrf2，誘導下游抗氧化酶和解毒酶表達，從而發(fā)揮了神經(jīng)保護作用。利用培養(yǎng)的原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞建立氧和葡萄糖剝奪/再氧合(OGD/R)模型，姜黃素在體內(nèi)的研究進一步證明了其在腦缺血中的作用［15］。Li 等人［16］證實在小鼠MCAO 模型中，熊果酸能顯著改善神經(jīng)功能，減少大腦梗死體積，并且脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物丙二醛的含量，促炎因子TLR4 及NF-KB 的mRNA 和蛋白水平也降低。進一步證實Nrf2 和HO-1 水平提高，而在Nrf2 基因敲除鼠中有更嚴重的大腦損傷。乳果糖［17］和新橘皮苷(NH)［18］經(jīng)口給予局部腦缺血的SD 大鼠后，能夠顯著改善神經(jīng)評分，減小梗阻面積，減輕氧化應激損傷以及TUNEL 染色陽性細胞的數(shù)量。這些作用與Nrf2 及HO-1 的表達增多密切相關(guān)。另有研究表明促紅細胞生成素(EPO)通過增加Nrf2 及HO-1 的表達，減輕腦水含量及梗阻體積［19］。萊菔硫烷缺血前預處理激活Nrf2 通路能夠減輕血腦屏障損傷，改善神經(jīng)缺陷［12］。以上研究提示通過誘導Nrf2的表達，激活Nrf2-Keap1-HO-1 途徑可能通過抗氧化應激、抗炎癥及抑制細胞凋亡作用，從而減輕腦卒中后的缺血再灌注損傷。

5 Nrf2-Keap1-GSH 在腦卒中的作用

GSH 是一種富含-SH，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的小分子三肽。GSH 是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，可無需酶的參與，直接與過氧化物、NO、羥自由基等進行反應，從而把機體內(nèi)有害物質(zhì)排泄出體外，減少氧化應激對脂質(zhì)、DNA 及蛋白質(zhì)造成損傷，因此GSH 通常被認為是機體抗氧化能力的一個重要指標［20］。

Satoh 等人［21］在腦組織培養(yǎng)缺血模型中利用親電子試劑NEPP 激活Nrf2 通路，發(fā)現(xiàn)GSH 和HO-1 水平明顯上調(diào)，細胞凋亡數(shù)量明顯降低，證實了Nrf2 及下游表達基因的保護作用。SD 大鼠腦皮質(zhì)原代星形細胞培養(yǎng)，建立OGD/R 模型，二咖啡?？鼘幩?1，5-diCQA)預處理顯著抑制了細胞死亡，提高細胞活性，減少ROS 產(chǎn)量，并且使GCL 活性增加，促進了GSH 的從頭合成。進一步運用Western Blot 方法顯示1，5-diCQA 觸發(fā)了Nrf2 核轉(zhuǎn)移。而當用siRNA 轉(zhuǎn)染細胞抑制Nrf2 表達時，這些保護作用消失。作者推測在體內(nèi)缺血/再灌注模型中，1，5-diCQA 通過激活Nrf2 途徑，上調(diào)GSH 合成，從而發(fā)揮抗氧化作用保護神經(jīng)細胞［22］。

Karen 等人［23］利用體內(nèi)OGD 模型和體外MCAO 模型發(fā)現(xiàn)，短暫的缺血預處理可引起腦缺血后Nrf2 目標基因的表達，并用real-time PCR 的方法證實與GSH 合成及利用有關(guān)的酶-GCL，谷氨酸鹽/胱氨酸反向轉(zhuǎn)運體(xCT)的表達也都增加。因此Nrf2 通過調(diào)控上述酶的表達來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)GSH含量，從而保護神經(jīng)細胞。Nrf2-Keap1-GSH 通路對缺血再灌注和其它物質(zhì)引起的氧化應激損傷都有保護作用。Burdo 等人［24］證實黃酮類化合物非瑟酮可以抵抗過氧亞磷酸鹽引起的神經(jīng)細胞氧化應激損傷，并且使Nrf2 的表達上調(diào)，GSH 合成的限速酶GCL 的含量增加。而加入GSH 合成抑制劑BSO后，神經(jīng)保護作用消失。因此非瑟酮可以通過激活Nrf2 途徑增加GSH 含量，增強細胞活性。另有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Nrf2 質(zhì)粒的NRK-52E 細胞在氧化應激損傷時，GSH 表達明顯高于對照組，并且應用基因沉默技術(shù)敲除Nrf2 基因后，NRK-52E細胞的GSH 表達與對照組相比明顯降低，細胞存活率降低［25］。

6 展 望

目前Nrf2 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究已成為研究熱點，眾多的研究已經(jīng)表明，Nrf2-Keap1 信號通路在腦卒中中可能是通過激活下游HO-1 及GSH 的表達發(fā)揮抗氧化應激、抗炎癥、抗凋亡等作用，但其具體機制還有待進一步闡明。同時我們也要關(guān)注Nrf2 持續(xù)激活可能帶來的不利后果如癌癥、動脈硬化等。雖然現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)很多Nrf2 激動劑，但是這些物質(zhì)能否應用于臨床仍是未來研究面臨的一大挑戰(zhàn)。隨著研究的深入，Nrf2-Keap1 將為腦卒中患者的治療提供新的思路。

［1］Moi P，Chan K，Asunis I，et al.Isolation of NF-E2-related factors 2(Nrf2)，a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control regions［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(21):9926－9930.

［2］Takagi Y，Kobayashi M，Li L，et al.MafT，a new member of the small Maf protein family in zebrafish［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，320(1):62－69.

［3］Nioi P，Nguyen T，Sherratt PJ，et al.The carboxy-termainal Neh3 domain of Nrf2 is required for transcriptional activation［J］.Mol Cell Biol，2005，25(24):10895－10906.

［4］Uruno A，Motohashi H.The Keap1-Nrf2 system as an in vivo sensor for electrophiles［J］.Nitric Oxide，2011，25(2):153－160.

［5］Kang MI，Kobayashi A，Wakabayashi N，et al.Scaffolding of Keap1 to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(7):2046－2051.

［6］Kansanen E，Kuosmanen SM，Leinonen H，et al.The Keap1-Nrf2 pathway:Mechanisms of activation and dysregulation in cancer［J］.Redox Biol，2013，18(1):45－49.

［7］Taquchi K，Motohashi H，Yamamoto M.Molecular mechanisms of the Keap1-Nrf2 pathway in stress response and cancer evolution［J］.Genes Cells，2011，16(2):123－140.

［8］Yang C，Zhang X，F(xiàn)an H，et al.Curcumin upregulates transcription factor Nrf2，HO-1 expression and protects rat brains against focal ischemia［J］.Brain Res，2009，1282:133－141.

［9］Tanaka N，Ikeda Y，Ohta Y，et al.Expression of Keap1-Nrf2 system and antioxidative proteins in mouse brain after transient middle cerebral artery occlusion［J］.Brain Res，2011，1370:246－253.

［10］Shang H，Yang D，Zhang W，et al.Time course of Keap1-Nrf2 pathway expression after experimental intracerebral haemorrhage:correlation with brain oedema and neurological deficit［J］.Free Radic Res，2013，47(5):368－375.

［11］張 瑩，盧 藝，曹 旭，等.Nrf2 在短暫性缺血再灌注大鼠星形膠質(zhì)細胞模型中的表達變化及其意義［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2010，27(5):388－391.

［12］Alfieri A，Srivastava S，Siow RC，et al.Sulforaphane preconditioning of the Nrf2/HO-1 defense pathway protects the cerebral vasculature against blood-brain barrier disruption and neurological deficits in stroke［J］.Free Radic Biol Med，2013，65:1012－1022.

［13］Paine A，Eiz-Vesper B，Blasczyk R，et al.Signaling to heme oxygenase-1 and its anti-inflammatory therapeutic potential［J］.Biochem Pharmacol，2010，80(12):1895－1903.

［14］Wang B，Cao W，Biswal S，et al.Carbon monoxide-activated Nrf2 pathway leads to protection against permanent focal cerebral ischemia［J］.Stroke，2011，42(9):2605－2610.

［15］Wu J，Li Q，Wang X，et al.Neuroprotection by curcumin in ischemic brain injury involves the Akt/Nrf2 pathway［J］.PLoS One，2013，8(3):59843.

［16］Li L，Zhang X，Cui L，et al.Ursolic acid promotes the neuro-protection by activating Nrf2 pathway after cerebral ischemia in mice［J］.Brain Res，2013，1497:32－39.

［17］Zhai X，Chen X，Shi J，et al.Lactulose ameliorates cerebral ischemiareperfusion injury in rats by inducing hydrogen by activating Nrf2 expression［J］.Free Radic Biol Med，2013，65:731－741.

［18］Wang JJ，Cui P.Neohesperidin attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury via inhibiting the apoptotic pathway and activating the Akt/Nrf2/HO-1 pathway［J］.J Asian Nat Prod Res，2013，15(9):1023－1037.

［19］Meng H，Guo J，Wang H，et al.Erythropoietin activates Keap1-Nrf2/ARE pathway in rat brain after ischemia［J］.Int J Neurosci，2013.

［20］Gebicki JM，Nauser T，Domazou A，et al.Reduction of protein radicals by GSH and ascorbate:potential biological significance［J］.Amino Acids，2010，39(5):1131－1137.

［21］Satoh T，Okamoto SI，Cui J，et al.Activation of the Keap1/Nrf2 pathway for neuroprotection by electrophilic phase II inducers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(3):768－773.

［22］Cao X，Xiao H，Zhang Y，et al.1，5-Dicaffeoylquinic acid-mediated glutathione synthesis through activation of Nrf2 protects against OGD/reperfusion-induced oxidative stress in astrocytes［J］.Brain Res，2010，1347:142－148.

［23］Bell KF，F(xiàn)owler JH，Al-Mubarak B，et al.Activation of Nrf2-regulated glutathione pathway genes by ischemic preconditioning［J］.Oxid Med Cell Longev，2011，2011:689524.

［24］Burdo J，Schubert D，Maher P，et al.Glutathione production is regulated via distinct pathways in stressed and non-stressed cortical neurons［J］.Brain Res，2008，1189:12－22.

［25］Li J，Jin J，Li M，et al.Role of Nrf2 in protection against triptolideinduced toxicity in rat kidney cells［J］.Toxicol Lett，2012，213(2):194－202.