趙 偉 ，鄧 敏 ，戴錫玲 ，李謙盛

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；2.上海辰山植物園 中國(guó)科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心，上海 201602；3上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 生態(tài)技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418)

煙葉唇柱苣苔Chirita heterotrichaMerr.為苦苣苔科Gesneriaceae唇柱苣苔屬Chirita的一種多年生草本植物，為我國(guó)海南省特有種，分布于瓊中、瓊海、保亭、三亞、白沙、東方等地，生于海拔400～600m的山谷林中或溪邊石上[1]。煙葉唇柱苣苔株高葉大，花色多樣(有藍(lán)紫色和白色)而艷麗，具有較高的觀賞價(jià)值[2-3]；同時(shí)全株可入藥，具有補(bǔ)腎虛、止血、止咳、除濕等功效[4]。人類活動(dòng)的干擾及森林資源的破壞導(dǎo)致了苦苣苔科植物生境的破壞；同時(shí)因?yàn)樵撝参镔Y源存在藥用價(jià)值，故存在掠奪性挖掘，這又使得其種群數(shù)量減少、分布區(qū)域變窄[5]，因此，開(kāi)展引種和人工繁殖栽培可有效保護(hù)和利用這一珍貴的植物資源。

目前，對(duì)苦苣苔科植物的研究主要集中于分類、系統(tǒng)進(jìn)化、花粉形態(tài)和發(fā)育和活性成分分析等方面[6-7]，而對(duì)其繁育和生理、引種和栽培等方面的研究報(bào)道卻有限。近年來(lái)，苦苣苔科植物已成為新興的觀賞植物資源，其觀賞價(jià)值逐漸為人們所認(rèn)識(shí)，有關(guān)其人工繁殖栽培等方面的研究工作也日益被人們關(guān)注。唇柱苣苔屬主要通過(guò)組織培養(yǎng)和扦插進(jìn)行無(wú)性繁殖，已有包括唇柱苣苔屬在內(nèi)的多種苦苣苔科植物的組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究獲得了成功，這為苦苣苔科植物的繁育和可持續(xù)利用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)[8]；也有多種關(guān)于利用唇柱苣苔屬植物葉片進(jìn)行扦插繁殖的研究報(bào)道[9-10]；而利用種子繁殖的研究?jī)H見(jiàn)于線葉唇柱苣苔C.linearifoliaW.T.Wang[11]。但是，有關(guān)唇柱苣苔屬植物生理學(xué)方面的研究報(bào)道卻很少，僅有菱葉唇柱苣苔C.subrhomboideaW.T.Wang[12]和桂林唇柱苣苔C.gueilinensisW.T.Wang的光合特性[13]和牛耳朵C.eburneaHance的低溫脅迫生理響應(yīng)[14]的研究報(bào)道。目前，已有對(duì)煙葉唇柱苣苔的組培快繁技術(shù)[15]、藥用價(jià)值[16]和花的發(fā)育機(jī)理[17-18]等方面的研究報(bào)道，卻未見(jiàn)有對(duì)其栽培生理方面的研究報(bào)道。多數(shù)苦苣苔科植物喜生于巖壁中性和酸性土壤，在栽培中需要選擇60％～70％遮陰的溫暖濕潤(rùn)環(huán)境，最適于其生長(zhǎng)的溫度條件一般為夜間16～18℃、白天27～30℃[19]。為了探明煙葉唇柱苣苔的高溫半致死溫度和高溫脅迫對(duì)其生理代謝的影響情況，本文利用組培繁殖得到的煙葉唇柱苣苔幼苗為材料，測(cè)定離體條件下煙葉唇柱苣苔葉片組織在系列高溫脅迫處理下電解質(zhì)滲出率的變化曲線，利用Logistic方程擬合并計(jì)算出煙葉唇柱苣苔的高溫半致死溫度(LT50)，并以LT50作為脅迫溫度處理煙葉唇柱苣苔植株，然后分析了葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性以及脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)含量等生理指標(biāo)的變化趨勢(shì)，旨在為煙葉唇柱苣苔的園藝栽培提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將野外采集于海南昌江(19°06′44″N、109°10′48″E，海拔 876m，樣本編號(hào)為DM2209)的煙葉唇柱苣苔活體植株引種栽培于上海辰山植物園的溫室內(nèi)，引種成活后取其葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，當(dāng)組培苗長(zhǎng)至3cm高時(shí)，將其移栽至長(zhǎng)與寬均為7cm、高為8cm的方形塑料花盆中，在加蓋保濕的育苗盒內(nèi)馴化成活后，置于上海辰山植物園科研中心的溫室中栽培5個(gè)月后選取長(zhǎng)勢(shì)大小基本一致的植株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 高溫半致死溫度的測(cè)定方法

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，選取從其基部數(shù)起的第3片完全展開(kāi)的成熟葉片，用去離子水洗凈，并用吸水紙吸干其表面的水滴，然后用直徑為6mm的打孔器避開(kāi)葉脈取葉圓片，隨機(jī)取4個(gè)葉圓片放入盛有10mL去離子水(電導(dǎo)率＜0.1 μS/cm)的試管中，于真空干燥器中用真空泵抽氣8min，使葉圓片沉入水中，并使其分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70℃的恒溫水浴鍋中保持20min，取出靜置冷卻2h；用電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率(REC1)后再全部放入100℃沸水浴中15min，殺死植物組織，取出冷卻后在室溫下測(cè)定電導(dǎo)率(REC2)[20]，重復(fù)3次。電解質(zhì)滲出率的計(jì)算公式如下：

電解質(zhì)滲出率＝REC1/REC2×100％。

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0擬合logistic方程：

式中：y表示電解質(zhì)滲出率(％)，x表示處理溫度，e為自然對(duì)數(shù)函數(shù)的底數(shù)，r為相對(duì)電導(dǎo)率飽和值，為100％，故取固定值100；a、b均為方程參數(shù)。

拐點(diǎn)即半致死溫度LT50＝ (lna)/b[21-22]。

1.3 高溫脅迫處理

將植株澆水充分后放進(jìn)光合有效輻射為40μmol·m-2s-1、溫度為25℃、濕度為70％、光照時(shí)間為16h的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后，將溫度調(diào)為按上述方法測(cè)定的高溫半致死溫度LT50，其余條件不變，每隔8h澆水1次，分別處理0、8、16、24、32、40、48、60h后，選取自基部數(shù)起的第3和第4片葉子進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.4 生理指標(biāo)的測(cè)定方法

采用抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[23]測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用愈創(chuàng)木酚法[24]測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性；采用硫代巴比妥酸法[25]測(cè)定丙二醛(MDA)含量；采用酸性茚三酮比色法[26]測(cè)定游離脯氨酸(Pro)含量。

2 結(jié)果和分析

2.1 煙葉唇柱苣苔的高溫半致死溫度

不同溫度處理下煙葉唇柱苣苔的電解質(zhì)滲出率如圖1。由圖1可知，電解質(zhì)滲出率隨著溫度的升高逐漸增加，于60℃下處理后其增幅趨于平緩。曲線擬合得到的logistic方程為：

y＝100/(1＋17.967e-0.068x)，擬合度R2＝0.962，高溫半致死溫度LT50＝42.3℃。

圖1 不同溫度處理下煙葉唇柱苣苔的電解質(zhì)滲出率Fig.1 Electrolyte leakage rates in C.heterotricha under different temperatures

2.2 不同LT50處理時(shí)間對(duì)煙葉唇柱苣苔葉片SOD活性的影響

不同LT50處理時(shí)間后煙葉唇柱苣苔SOD活性的變化曲線如圖2所示。在LT50溫度下，SOD活性呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在以LT50溫度處理0～8h后快速上升，而處理8～16h又趨于平緩，SOD活性達(dá)到最大，處理16h后SOD活性卻明顯快速下降。

2.3 不同LT50處理時(shí)間對(duì)煙葉唇柱苣苔葉片POD活性的影響

不同LT50處理時(shí)間后煙葉唇柱苣苔POD活性的變化曲線如圖3所示。在LT50脅迫下，POD活性在以LT50溫度處理0～24h時(shí)快速上升，處理24h時(shí)達(dá)到最大值，而后又急劇下降，且在處理48h后降到低于處理前的水平。

2.4 不同LT50處理時(shí)間對(duì)煙葉唇柱苣苔葉片MDA含量的影響

不同LT50處理時(shí)間后煙葉唇柱苣苔MDA含量的變化曲線如圖4所示。在LT50脅迫下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MDA含量呈持續(xù)上升的變化趨勢(shì)，在以LT50溫度處理0～8h時(shí)其平緩上升，處理8～24h時(shí)卻急劇上升，而在處理24～48h后又平緩上升，處理48h后又加速升高。處理60h時(shí)MDA含量分別是處理0 與48h時(shí)MDA含量的2.3和1.39倍。

圖2 不同LT50處理時(shí)間后煙葉唇柱苣苔SOD活性的變化曲線Fig.2 Change of SOD activity in C.heterotricha for different durations at LT50

圖3 不同LT50處理時(shí)間后煙葉唇柱苣苔POD活性的變化曲線Fig.3 Change of POD activity in C.heterotricha for different durations at LT50

2.5 不同LT50處理時(shí)間對(duì)煙葉唇柱苣苔葉片Pro含量的影響

不同LT50處理時(shí)間后煙葉唇柱苣苔脯氨酸含量的變化曲線如圖5所示。在LT50脅迫下，Pro含量也隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而呈持續(xù)上升的變化趨勢(shì)，在以LT50溫度處理0～24h時(shí)其呈近似線性的增加趨勢(shì)。在處理24～40h時(shí)Pro的增幅相對(duì)平緩，處理40h時(shí)Pro含量是處理前的18.5倍，處理48h時(shí)的含量是處理前的33.5倍。處理60h時(shí)，Pro含量達(dá)到最大值，是處理前的36.3倍。

圖4 不同LT50處理時(shí)間后煙葉唇柱苣苔MDA含量的變化曲線Fig.4 Change of MDA content in C.heterotricha for different durations at LT50

圖5 不同LT50處理時(shí)間后煙葉唇柱苣苔脯氨酸含量的變化曲線Fig.5 Change of proline content in C.heterotricha for different durations at LT50

3 討 論

溫度對(duì)于植物的形態(tài)、分布、代謝以及生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用。在高溫脅迫下，一般先直接誘發(fā)植物脫水，在細(xì)胞逐漸失水萎縮過(guò)程中，膜透性增大，電解質(zhì)外滲，細(xì)胞受到傷害[27]。利用系列溫度梯度下植物組織電解質(zhì)的滲出率求得的半致死溫度(LT50)是評(píng)價(jià)植物耐性較為靈敏和準(zhǔn)確的指標(biāo)[28-29]。本試驗(yàn)用電解質(zhì)滲出率配合logistic方程測(cè)得煙葉唇柱苣苔的半致死溫度LT50為42.3℃。電解質(zhì)滲出率隨著溫度的升高而增大，其變化曲線近似S型，logistic方程擬合度高。以42℃的高溫處理煙葉唇柱苣苔8h，其葉片便失水下垂，處理16h葉片繼續(xù)下垂，至處理40h葉片便已經(jīng)灼傷而有局部變干，處理48和60h后葉柄下垂，植株萎蔫。

SOD酶是存在于植物體內(nèi)的一種重要的保護(hù)酶，它能清除體內(nèi)的氧自由基，從而保護(hù)質(zhì)膜不受超氧陰離子自由基的破壞。SOD是一種典型的誘導(dǎo)酶，植物在遭到逆境脅迫時(shí)，會(huì)啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制，先通過(guò)增加SOD活性來(lái)清除超氧陰離子自由基，提高對(duì)高溫的耐受性，減少對(duì)自身的傷害[30]。植物遭受逆境脅迫的主要特征是活性氧代謝的失調(diào)，最主要的傷害是對(duì)內(nèi)酶的破壞，造成細(xì)胞的正常代謝受阻，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育中止或死亡[31]。研究中發(fā)現(xiàn)，高溫LT50脅迫下SOD活性隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)先升高，在脅迫24h時(shí)達(dá)到最大值，然后再下降。該變化趨勢(shì)與低溫脅迫下唇柱苣苔屬牛耳朵以及菲油果屬的菲油果的SOD活性的變化趨勢(shì)一致[14,32]。在短時(shí)間內(nèi)，植物可通過(guò)提高酶活性來(lái)清除氧自由基以保護(hù)自身，但在長(zhǎng)時(shí)間脅迫后，酶逐漸變性失活，同時(shí)生理代謝受到抑制，酶的產(chǎn)生量也減少。

POD酶是植物體在逆境下清除羥自由基的酶促防御系統(tǒng)中的重要酶之一。本研究結(jié)果表明，與SOD相似，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，POD活性先升高后降低，在LT50脅迫24h時(shí)其活性達(dá)到最大，在此處理階段，POD活性隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其清除羥自由基的能力較強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞未造成明顯的傷害，能通過(guò)酶促系統(tǒng)減輕自身在逆境下的傷害。在LT50脅迫24h之后，POD活性快速下降，而羥自由基的積累增加，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化程度加深，對(duì)植物細(xì)胞造成損傷，影響植物的正常代謝[32-33]。

MDA是植物在逆境條件下或衰老時(shí)發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，通常用其表示植物膜脂過(guò)氧化程度和膜系統(tǒng)傷害程度[34]。本研究結(jié)果表明，MDA含量呈上升趨勢(shì)，與灰?guī)r皺葉報(bào)春在高溫45℃處理下MDA含量的變化趨勢(shì)相同[35]。在LT50脅迫0～8h時(shí)MDA緩慢積累，脅迫8～24h積累速率加快，而后又平緩積累，在脅迫48h后MDA急劇增加，說(shuō)明植物隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)其膜脂過(guò)氧化程度加重。

脯氨酸(Pro)作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，普遍存在于植物體內(nèi)，當(dāng)植物受到非生物因素的脅迫時(shí)，都會(huì)直接或間接地發(fā)生水分脅迫。為了適應(yīng)逆境脅迫，植物通常會(huì)在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)迅速大量地合成和積累脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)增強(qiáng)其對(duì)滲透脅迫的抵抗能力。脯氨酸也是多種自由基的清除劑，還可激發(fā)植物體內(nèi)POD、CAT、SOD等酶的活性[36]。本研究結(jié)果表明，Pro含量在高溫脅迫下接近線性積累，急劇升高，Pro對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)是迅速而敏感的，通過(guò)提高脯氨酸含量來(lái)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高對(duì)高溫脅迫的耐性[37]。在LT50脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，煙葉唇柱苣苔植株形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，在脅迫40h時(shí)葉片已經(jīng)嚴(yán)重失水，且有灼傷跡象，處理48和60h后其已萎蔫，說(shuō)明脅迫對(duì)植物已造成了不可逆的傷害。

綜上所述，通過(guò)電導(dǎo)率法配合logistic方程可以簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地測(cè)定煙葉唇柱苣苔的高溫半致死溫度，再結(jié)合生理生化指標(biāo)評(píng)價(jià)其高溫脅迫下的生理響應(yīng)，可以有效評(píng)估其高溫適應(yīng)性，從而為煙葉唇柱苣苔設(shè)施栽培的溫度調(diào)控提供了理論依據(jù)。

[1] 李振宇,王印政.中國(guó)苦苣苔科植物[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社,2005.

[2] 溫 放,張啟翔,王 越.廣西唇柱苣苔屬和小花苣苔屬植物的觀賞性狀評(píng)價(jià)與篩選[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(2):239-250.

[3] 史佑海,徐世松,黃覺(jué)武.海南苦苣苔科野生植物資源及其觀賞特性評(píng)價(jià)[J].北方園藝,2011,(11):79 -82.

[4] 田建平,胡遠(yuǎn)艷,張俊清,等.海南特有維管植物的藥用資源[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,14(2):122-125.

[5] 王玉兵,梁宏偉,陳發(fā)菊,等.廣西特有植物瑤山苣苔的瀕危原因及保護(hù)對(duì)策[J].生態(tài)環(huán)境,2008,17(5):1956-1960.

[6] 溫 放,李湛東.苦苣苔科(Gesneriaceae)植物研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源,2006,25(1):1-6.

[7] 鄭曉珂,李 軍,馮衛(wèi)生,等.苦苣苔科植物研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志,2003,12(4):261-263.

[8] 李 翠,凌征柱,姚紹嫦,等.苦苣苔科植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(31):17387-17388,17390.

[9] 溫 放,張啟翔.5種唇柱苣苔屬植物葉插繁殖方式研究[J].北方園藝,2007,(12):103-105.

[10] 周太久,黃仕訓(xùn),鄧 濤,等.6種唇柱苣苔屬植物葉插繁殖試驗(yàn)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,43(3):356-359.

[11] 潘春柳,呂惠珍,彭玉德,等.外源激素處理對(duì)線葉唇柱苣苔種子萌發(fā)的影響[J].種子,2011,(1):24-27.

[12] 鄧 濤,莫 丹,周太久,等.菱葉唇柱苣苔光合特性日變化的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,(4):195-197.

[13] 鄧 濤,周太久,盤 波,等.影響桂林唇柱苣苔光合速率日變化的因子分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(6):154-156.

[14] 孫國(guó)勝,鄧 敏,李謙盛,等.牛耳朵幼苗對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,43(6):918-923.

[15] Tang Z H,Shi L,Chen W,et al.In vitro propagation ofChirita heterotrichaMerr[J].Propagation of Ornamental Plants,2007,7(1):43-48.

[16] 李家美,常 穎,夏 至.唇柱苣苔屬5種藥用植物的考證[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,(1):103-105.

[17] Gao Q,Tao J H,Yan D,et al.Expression differentiation of CYC-like floral symmetry genes correlated with their protein sequence divergence inChirita heterotricha(Gesneriaceae)[J].Development genes and evolution,2008,218(7):341-351.

[18] Yang X,Cui H,Yuan Z L,et al.Significance of consensus CYC-binding sites found in the promoters of both ChCYC and ChRAD genes inChirita heterotricha(Gesneriaceae)[J].Journal of Systematics and Evolution,2010,48(4):249-256.

[19] 代正福,羅冠勇.中國(guó)熱帶特有野生苦苣苔科觀賞植物資源[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(1):13-15.

[20] 趙亞洲,卓麗環(huán),張 琰.2種紅楓的高溫半致死溫度與耐熱性[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,22(2):51-53.

[21] 朱根海,劉祖棋,朱培仁.應(yīng)用Logistic方程確定植物組織低溫半致死溫度的研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1986,(3):11-16.

[22] 董江水.應(yīng)用SPSS軟件擬合Logistic曲線研究[J].金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào),2007,23(1):21-24.

[23] Beauchamp C,Fridovich I.Superoxide dismutase:improved assays and an assay applicable to acrylamide gels[J].Anal Biochem,1971,44 (1):276-287.

[24] Flurkey W H,Jen J J.Peroxidase and polyphenoloxidase activities in developing peaches [J].Journal of Food Science,1978,43:1826-1828,1831.

[25] Heath R L,Packer L.Photoperoxidation in isolated chloroplasts I Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J].Arch Biochem Biophys,1968,125:189-190.

[26] Chinard F P.Photometric estimation of proline and ornithine [J].J Biol Chem,1952,199:91-95.

[27] Hafeezur R,Saeed A M,Saleem M.Heat tolerance of upland cotton during the fruiting stage evaluated using cellular membrane thermostability [J].Field Crops Research,2004,85:149-158.

[28] He X Y,Ye H,Ma J L,et al.Semi-lethal high temperature and heat tolerance of eightCamelliaspecies[J].Phyton,2012,81:177-180.

[29] 馬錦林,張日清,葉 航,等.香花油茶的半致死溫度與耐寒耐熱性[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2013,31(1):150-152,175.

[30] 李鐵華,張 偉,文仕知,等.貯藏溫度與時(shí)間對(duì)櫸樹(shù)種子活力以及抗氧化特性的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(9):1-5.

[31] 唐 麗,張 瑜,袁德義.人工低溫脅迫條件下菲油果各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(11):8-13.

[32] 陳培琴,郁松林,詹妍妮,等.植物在高溫脅迫下的生理研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,(5):223-227.

[33] 張桂蓮,陳立云,張順堂,等.高溫脅迫對(duì)水稻劍葉保護(hù)酶活性和膜透性的影響[J].作物學(xué)報(bào),2006,32(9):1306-1310.

[34] 陳 貴,胡文玉,謝甫綈.提取植物體內(nèi) MDA 的溶劑及 MDA作為衰老指標(biāo)的探討[J].植物生理學(xué)通訊,1991,27(1):44-46.

[35] 張 路,張啟翔.高溫脅迫對(duì)灰?guī)r皺葉報(bào)春生理指標(biāo)的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,24(5):1728-1732.

[36] 焦 蓉,劉好寶,劉貫山,等.論脯氨酸累積與植物抗?jié)B透脅迫[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(7):216-221.

[37] 廖飛雄,潘瑞熾.熱脅迫下菜心脯氨酸含量變化及其在耐熱中的作用[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2001,(2):45-49.