王碧芳 ，袁德義 ，劉冬明 ，范曉明 ，唐 靜 ，鄒 鋒

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)a.林學(xué)院；b.經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083)

錐栗Castanea henryiRehd.et Wils.屬于殼斗科栗屬堅果類植物，為我國重要的木本糧食樹種之一[1-2]。錐栗果實營養(yǎng)價值很高，含有豐富的淀粉、糖、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、抗壞血酸及胡蘿卜素，越來越受到大眾的青睞[3]。錐栗為典型的異花授粉植物，要獲得優(yōu)良的錐栗新品種，主要途徑之一就是人工雜交育種，而保存花粉是雜交育種過程中的重要環(huán)節(jié)。錐栗雜交育種普遍存在花期不遇和授粉授精不良的問題，這會致使空苞率高而坐果率低[4]。貯藏花粉可以克服雜交育種中異地雜交和花期不遇的困難。目前，對百合[5]、牡丹[6]、油茶[7]、玉蘭[8]、紅心杉[9]、桉樹[10]的花粉貯藏特性的研究報道較多，而有關(guān)錐栗花粉貯藏特性的研究報道則較少。為給錐栗的雜交育種及其花粉資源的保存等方面的研究提供參考，以錐栗花粉為試驗材料，對其花粉的貯藏特性進行了試驗研究，現(xiàn)將研究結(jié)果分析報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以錐栗‘華栗4號’的花粉為試材，材料采自湖南省郴州市汝城縣中南林業(yè)科技大學(xué)實驗基地內(nèi)7年生正常結(jié)果的錐栗優(yōu)良單株。試驗地年平均氣溫16.6℃，年平均降水量1 547.1mm，平均日照1 713h，無霜期273d。試驗地的水肥條件良好，管理措施和立地條件完全一致。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉的收集

于2013年5月采集錐栗‘華栗4號’盛花期的花粉，參照唐靜等人[3]的方法，用牙刷刷下花序上的花藥，置于硫酸紙上放在100 W燈泡下烘烤，把溫度控制在30℃左右，花粉散出后用硫酸紙包成小包以備用。

1.2.2 花粉貯藏條件試驗

將收集到的花粉分別采用離心管自然密封和離心管加入干燥劑(硅膠)密封的不同方式進行密封處理，再將以不同方式密封的花粉分別貯藏于室溫和4、-20和-80℃這4種溫度環(huán)境中，每隔一定時間檢測花粉的萌發(fā)率，檢測前要作冰上解凍處理[11]。

1.2.3 花粉生活力的測定

以花粉萌發(fā)率作為花粉生活力的測定指標(biāo)[12]，運用離體萌發(fā)測定法進行測定。以10％蔗糖＋1％瓊脂＋0.005％硼酸[3]為固體培養(yǎng)基，將花粉撒播于培養(yǎng)基上，置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)30h，然后用Olympus顯微鏡觀察其萌發(fā)情況。每個處理3次重復(fù)，每次重復(fù)隨機選取5個視野，每個視野觀測的花粉粒數(shù)不少于50粒。統(tǒng)計時以花粉管長度超過花粉粒直徑記為萌發(fā)，花粉萌發(fā)率的計算公式[13]如下。

花粉萌發(fā)率(％)＝(已經(jīng)萌發(fā)的花粉數(shù)/花粉總數(shù))×100。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 室溫貯藏條件下花粉生活力的變化情況

在室溫環(huán)境中不同干燥條件和貯藏時間下‘華栗4號’花粉的萌發(fā)率如圖1所示。從圖1中可以看出，同樣是室溫貯藏，因為濕度和貯藏時間不同，故花粉的生活力有差異，花粉活力變化的總趨勢為，隨著貯藏天數(shù)的增加，其萌發(fā)率下降，且非干燥貯藏的效果優(yōu)于干燥貯藏的效果。在室溫干燥條件下，‘華栗4號’花粉貯藏9d后其萌發(fā)率降為27.4％；貯藏15d后，其萌發(fā)率降到了15.7％；貯藏27d后，其萌發(fā)率僅為2.4％。干燥貯藏處理的花粉其萌發(fā)趨勢與非干燥貯藏處理的相似。在室溫非干燥條件下，‘華栗4號’花粉貯藏9d，其生活力仍較高，為35.5％；貯藏15d后，其萌發(fā)率仍為25.9％；貯藏27d后，其萌發(fā)率降至6.4％?？傮w來看，錐栗‘華栗4號’花粉在室溫條件下的貯藏期較短，貯藏27d左右其生活力基本喪失。

圖1 室溫條件下不同處理方式對‘華栗4號’花粉萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of different treatments on germination rates of ‘Huali No.4’ pollens at room temperature

2.2 4℃貯藏條件下花粉生活力的變化情況

在4℃的溫度環(huán)境中不同干燥條件和貯藏時間下‘華栗4號’花粉活力的變化情況如圖2所示。由圖2可知，‘華栗4號’花粉的萌發(fā)率隨著貯藏時間的延長而降低，且非干燥處理的貯藏效果優(yōu)于干燥處理的貯藏效果。在4℃干燥條件下，‘華栗4號’花粉貯藏20d后其萌發(fā)率降為28.5％；貯藏90d后其萌發(fā)率的下降幅度較大，下降了47.9％；貯藏至120d其萌發(fā)率僅為3.3％。在4℃非干燥條件下，‘華栗4號’花粉貯藏20d后其萌發(fā)率仍較高，為34.5％；貯藏90d后其萌發(fā)率的下降幅度亦較大，下降了42.8％；貯藏至120d后其萌發(fā)率降至6.3％。與室溫貯藏的相比，在4℃低溫冷藏條件下，‘華栗4號’花粉的生活力保持較好，貯藏30d后其萌發(fā)率仍然較高，非干燥貯藏處理的花粉其萌發(fā)率為32.6％，而干燥貯藏處理的花粉其萌發(fā)率只有26.9％。

圖2 4℃條件下不同處理方式對‘華栗4號’花粉萌發(fā)率的影響Fig.2 Effect of different treatments on germination rates of ‘Huali No.4’ pollens at 4℃

2.3 -20℃貯藏條件下花粉生活力的變化情況

在-20℃的低溫環(huán)境中不同干燥條件和貯藏時間下‘華栗4號’花粉的萌發(fā)率如圖3所示。由圖3可知，與4℃貯藏條件的相比，在-20℃的低溫條件下，花粉的萌發(fā)率隨著貯藏時間的推移而下降的速度明顯減緩，且非干燥處理的貯藏效果優(yōu)于干燥處理的貯藏效果，其具體變化情況如下：干燥貯藏處理和非干燥貯藏處理的花粉其生活力均一直呈下降趨勢；花粉貯藏30d后，干燥貯藏處理和非干燥貯藏處理的花粉其生活力的下降速度間無明顯差異；貯藏60d后，干燥貯藏處理的花粉其生活力的下降速度要快于非干燥貯藏處理的；花粉在-20℃下冷凍120d后，干燥貯藏處理和非干燥貯藏處理的花粉其萌發(fā)率分別為21.7％和27.5％，而在4℃低溫下冷藏120d后的花粉幾乎全部喪失了活力；在-20℃低溫下貯藏210d后，干燥貯藏處理與非干燥貯藏處理的花粉其萌發(fā)率均已降到10％以下。

2.4 -80℃貯藏條件下花粉生活力的變化情況

對在-80℃的低溫環(huán)境中分別貯藏了30、60、90、120、150、180、210、240、270d 的 花粉生活力的測定結(jié)果如圖4。由圖4可知，‘華栗4號’花粉萌發(fā)率的下降幅度較小，呈緩慢下降趨勢，且非干燥貯藏效果優(yōu)于干燥貯藏效果。在-80℃非干燥條件下，花粉貯藏90d時其萌發(fā)率仍較高，為45.4％；貯藏210d后其萌發(fā)率降為21.6％；貯藏至270d時其萌發(fā)率降至8.1％。干燥貯藏處理的花粉萌發(fā)趨勢與非干燥貯藏處理的萌發(fā)趨勢相似。在-80℃干燥條件下貯藏90d后，花粉萌發(fā)率降為43.8％；貯藏210d后其萌發(fā)率降為17.3％；貯藏至270d時其萌發(fā)率僅為5.4％，已不宜用于人工授粉?？傮w來看，與-20℃的低溫條件相比，在-80℃的低溫冷凍條件下，花粉的生活力保持較好，貯藏210d后其萌發(fā)率仍在17％以上；而在-20℃的低溫下冷凍120d后花粉的生活力基本喪失(如圖4)。

圖3 -20℃條件下不同處理方式對‘華栗4號’花粉萌發(fā)率的影響Fig.3 Effect of different treatments on germination rates of ‘Huali No.4’ pollens at - 20℃

圖4 -80℃條件下不同處理方式對‘華栗4號’花粉萌發(fā)率的影響Fig.4 Effect of different treatments on germination rates of ‘Huali No.4’ pollens at - 80℃

3 結(jié)論與討論

一般認為，貯藏溫度越低花粉壽命越長。賈文慶等人[14]研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾花粉在常溫貯藏20d后其活力基本喪失，而在-196℃干燥條件下其耐貯藏時間可達400d以上。紅花酢漿草花粉在室溫貯藏6d后就不再萌發(fā)，而在-80℃的真空干燥環(huán)境下花粉活力可維持28d[15]。本研究結(jié)果表明：在4種貯藏溫度條件下，錐栗‘華栗4號’花粉生活力均隨著貯藏時間的延長而下降，室溫下花粉的生活力下降最快而貯藏時間最短，-80℃下其生活力下降最慢而貯藏時間最長?！A栗4號’室溫貯藏27d后花粉活力基本喪失，這可能因為室內(nèi)溫度較高，花粉內(nèi)部呼吸作用增強，營養(yǎng)消耗殆盡而亡，同時室溫下花粉粒又容易脫水死亡。本試驗結(jié)果表明，‘華栗4號’花粉在室溫貯藏6d后其萌發(fā)率仍在34％以上，而鄭誠樂等人[16]認為，錐栗‘白露仔’在室溫貯藏6d后其萌發(fā)率為0，這可能與本試驗所用的品種及貯藏時的含水量不同有關(guān)。4℃適于‘華栗4號’花粉的短期貯藏，貯藏30d時其萌發(fā)率仍在26％以上；而-20、-80℃的低溫條件適于‘華栗4號’花粉的長期貯藏，且-80℃下花粉的耐貯藏能力更好，‘華栗4號’在-20℃下貯藏90d時其生活力在26％以上，貯藏210d后其生活力基本喪失，而在-80℃的低溫條件下貯藏210d時，‘華栗4號’花粉的生活力在17％以上，貯藏270d后仍有一定的生活力。

花粉的生活力除了與溫度密切相關(guān)外，還受到貯藏環(huán)境的濕度、花粉自身含水量的影響[17]。大多數(shù)植物的花粉最適貯藏濕度都在60％以下，也有研究發(fā)現(xiàn)，有很多物種的花粉在貯藏時的相對濕度不能低于40％，否則，花粉的生活力便很快降低[18]。本研究結(jié)果表明：在4種貯藏溫度條件下，非干燥貯藏效果均優(yōu)于干燥貯藏效果，這與呂晉慧等人[11]和王小敏等人[19]的干燥時間過長、花粉含水量過低影響花粉活力的觀點一致。

綜上所述，錐栗‘華栗4號’花粉在-80℃非干燥環(huán)境下貯藏的效果最好，貯藏210d后其生活力達21.8％，貯藏270d后仍有一定的生活力。至于更低溫度條件(-196℃)液氮貯藏對錐栗花粉生活力的影響情況尚待今后繼續(xù)研究。

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