朱衍杰，張秀省，穆紅梅

(聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059)

康寧霉素是從海洋生物中提取出的一種木霉多肽物質(zhì)。木霉Trichoderma是一類重要的植物病害的生防真菌，按照傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)，其隸屬于半知菌亞門Deuteromycotina絲孢綱Hyphomycetes絲孢目Hyphomycetales絲孢科 Hyphomycetaceae[1]。

Weinding首先發(fā)表了木霉對(duì)幾種土壤真菌的拮抗作用的研究結(jié)果[2]。因其對(duì)多種病原真菌在體外或體內(nèi)均表現(xiàn)出拮抗作用，所以木霉是國(guó)內(nèi)外研究者研究較多的一種生防真菌[3]。多年來，人們對(duì)木霉的研究多集中于其防病作用、生物制劑的開發(fā)以及生防機(jī)制的研究等方面，對(duì)其促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面的研究報(bào)道較為鮮見。近年來，人們發(fā)現(xiàn)除了在生物防治方面有重要的作用外，木霉具有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用，一些木霉的代謝產(chǎn)物中含有赤霉素等物質(zhì)，赤霉素能夠打破種子的休眠[4]，調(diào)控幼苗植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)[5]，所以木霉類物質(zhì)在促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)方面效果顯著，并在誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性方面有較好的作用[6]。Chang等用以泥土或糠為基質(zhì)培養(yǎng)的哈茨木霉處理土壤，可以提高辣椒、長(zhǎng)春花和菊花等植物的發(fā)芽率，并出現(xiàn)開花早而多、植株株高及鮮質(zhì)量增加的現(xiàn)象[7]?，F(xiàn)有研究證明康寧霉素在一定濃度范圍內(nèi)可以提高皂莢種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)等，促進(jìn)了皂莢種子的萌發(fā)[8]。魏林[9]等應(yīng)用哈茨木霉T2-16菌株的培養(yǎng)產(chǎn)物對(duì)豇豆種子進(jìn)行浸種處理，發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵產(chǎn)物在適宜濃度下可顯著提高豇豆種子的活力指數(shù),增進(jìn)種子的萌發(fā)速率，減少物質(zhì)外滲量，使豇豆種子有較強(qiáng)的成苗能力和生長(zhǎng)性能。孫峰[10]用哈茨木霉RT-12發(fā)酵產(chǎn)物處理抗蟲棉種子時(shí)發(fā)現(xiàn)木霉發(fā)酵產(chǎn)物也可以降低種子的相對(duì)電導(dǎo)率。魏林[11]等應(yīng)用哈茨木霉T2-16菌株發(fā)酵產(chǎn)物，對(duì)5個(gè)雜交水稻種子進(jìn)行浸種和發(fā)芽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)使用木霉T2-16發(fā)酵產(chǎn)物浸種后，減輕了在種子萌發(fā)過程中生理代謝產(chǎn)生的自由基或種子吸脹過程中對(duì)細(xì)胞膜所造成的傷害，保護(hù)了細(xì)胞膜的完整性，從而減少細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)大分子物質(zhì)外滲，降低了種子的相對(duì)電導(dǎo)率。目前，關(guān)于木霉生防方面的研究主要在蔬菜和農(nóng)作物上得到應(yīng)用，尚未見關(guān)于園林綠化樹種的相關(guān)研究報(bào)道。本文中采用新型的生物制劑來處理國(guó)槐種子，以探究木霉在促進(jìn)種子萌發(fā)方面的應(yīng)用潛力，為木霉制劑在園林育苗生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為國(guó)槐的繁殖栽培提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2012年采集于聊城市冠縣國(guó)槐苗圃成熟的國(guó)槐種子為試驗(yàn)材料。

1.2 試劑與儀器

試驗(yàn)中用到的試劑有：康寧霉素提取液(由山東大學(xué)生命科學(xué)院微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)，牛血清白蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，85％磷酸，無水乙醇，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，蔗糖，可溶性淀粉，蒽酮，乙酸乙酯，高氯酸，濃硫酸，石油醚，雙蒸水，蒸餾水。

試驗(yàn)中用到的儀器有：試管(15mL)若干支，濾紙，玻璃棒，電導(dǎo)率儀(DDS-307)，索氏脂肪提取器，水浴鍋，烘箱，電子分析天平，恒溫箱，紫外分光光度計(jì)，離心機(jī)，研缽，燒杯，試管，容量瓶，棕色瓶，脫脂濾紙等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 國(guó)槐種子電導(dǎo)率的測(cè)定

采用改進(jìn)的蘇紅[12]等的方法來測(cè)定電導(dǎo)率。將國(guó)槐種子用康寧霉素分別浸種6、12、18、24、30h，每階段選取大小一致且無損傷的國(guó)槐種子3g左右，每個(gè)處理3次重復(fù)，用雙蒸水沖洗數(shù)次后，用濾紙吸干表面水分，分別裝入試管中，加入10mL雙蒸水，在25℃下浸泡24h，同時(shí)將只裝雙蒸水的對(duì)照試管也置于該溫度下。浸泡結(jié)束后，充分搖勻試管里的浸出液，測(cè)定浸出液和對(duì)照雙蒸水的電導(dǎo)率，根據(jù)公式計(jì)算每個(gè)處理下單位質(zhì)量國(guó)槐種子的電導(dǎo)率。計(jì)算公式如下：

電導(dǎo)率＝(E1-E0)/G。

式中，“E1”表示浸出液的電導(dǎo)率，“E0”表示雙蒸水的電導(dǎo)率，“G” 表示種子質(zhì)量。

1.3.2 國(guó)槐種子內(nèi)含物含量及抗氧化酶活性的測(cè)定

取浸種開始到發(fā)芽結(jié)束過程中不同階段的國(guó)槐種子，進(jìn)行各指標(biāo)含量的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定種子內(nèi)的蛋白含量；用蒽酮法測(cè)定種子內(nèi)可溶性糖和淀粉的含量；采用索氏提取器法測(cè)定種子內(nèi)粗脂肪含量，采用紫外吸收法測(cè)定種子萌發(fā)過程中CAT酶活性[13]；采用愈創(chuàng)木酚法、氮藍(lán)四唑法分別測(cè)定種子萌發(fā)過程中POD、SOD保護(hù)酶的活性[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸種時(shí)間對(duì)國(guó)槐種子電導(dǎo)率的影響

國(guó)槐種子經(jīng)過處理后，種子細(xì)胞膜的完整性會(huì)發(fā)生一些變化，可由種子電導(dǎo)率的變化顯現(xiàn)出來，不同浸種時(shí)間對(duì)國(guó)槐種子電導(dǎo)率的影響如圖1所示。由圖 1可以看出，康寧霉素浸種24h時(shí)的電導(dǎo)率略低于其它浸種時(shí)間的處理，且與對(duì)照相比，隨著康寧霉素質(zhì)量濃度的降低電導(dǎo)率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，并在康寧霉素質(zhì)量濃度為0.3mg/L時(shí)，種子的電導(dǎo)率最低，分別為23.11、19.73、13.94、9.11、17.03 μs·cm-1g-1，且與對(duì)照相比存在顯著差異(p＜0.05)。在最適質(zhì)量濃度下，其余各浸種時(shí)段中國(guó)槐種子的電導(dǎo)率均高于浸種24h的國(guó)槐種子，說明康寧霉素在浸種24h下可以在一定程度上降低種子的電導(dǎo)率，減少種子內(nèi)有機(jī)物質(zhì)等的外滲，對(duì)種子的細(xì)胞膜產(chǎn)生一定程度上的保護(hù)作用，可以保持種子細(xì)胞膜的完整性。

圖1 不同康寧霉素處理對(duì)國(guó)槐種子電導(dǎo)率的影響Fig.1 Effect of different T.koningii treatments on electrical conductivity of S.japonica seeds

2.2 不同浸種時(shí)間對(duì)國(guó)槐種子內(nèi)含物含量的影響

不同浸種時(shí)間對(duì)國(guó)槐種子內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉、粗脂肪含量的影響如圖 2～5所示。由圖2～5可知，從浸種到種子發(fā)芽結(jié)束的整個(gè)過程中，種子內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉、粗脂肪含量的變化規(guī)律與種子電導(dǎo)率的變化規(guī)律相吻合。隨著浸種和發(fā)芽的進(jìn)行，種子內(nèi)各物質(zhì)的含量大體呈先增加后減少的趨勢(shì)，并且在浸種24h時(shí)種子內(nèi)各物質(zhì)含量最大，在發(fā)芽第7天時(shí)種子內(nèi)各物質(zhì)含量開始出現(xiàn)明顯變化，發(fā)芽第14天時(shí)，種子內(nèi)各物質(zhì)的含量降至最低。另外，浸種過程中，隨著康寧霉素質(zhì)量濃度的降低，國(guó)槐種子內(nèi)各物質(zhì)含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在康寧霉素質(zhì)量濃度為0.3mg/L時(shí)各物質(zhì)含量最高，種子內(nèi)有機(jī)物質(zhì)流失較少，且在此質(zhì)量濃度下與對(duì)照相比差異顯著(p＜0.05)。發(fā)芽過程中，經(jīng)康寧霉素處理后，種子內(nèi)各物質(zhì)含量在發(fā)芽第7天時(shí)開始出現(xiàn)明顯變化，發(fā)芽第14天時(shí)可溶性糖和脂肪消耗速度開始減慢，可溶性蛋白、淀粉消耗速度加快，但與對(duì)照相比，各質(zhì)量濃度之間差異不顯著(p＞0.05)，種子內(nèi)含有的各物質(zhì)含量大體上在300～0.3mg/L范圍內(nèi)呈下降趨勢(shì)，在0.3～0.003mg/L范圍內(nèi)呈增加趨勢(shì)，在康寧霉素質(zhì)量濃度為0.3mg/L時(shí)種子內(nèi)各物質(zhì)含量最少。

圖2 不同康寧霉素處理對(duì)國(guó)槐種子中可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of different T.koningii treatments on soluble protein content in S.japonica seeds

圖3 不同康寧霉素處理對(duì)國(guó)槐種子中可溶性糖含量的影響Fig.3 Effect of different T.koningii treatments on soluble sugar content in S.japonica seeds

圖4 不同康寧霉素處理對(duì)國(guó)槐種子中淀粉含量的影響Fig.4 Effect of different T.koningii treatments on starch content in S.japonica seeds

圖5 不同康寧霉素處理對(duì)國(guó)槐種子中粗脂肪含量的影響Fig.5 Effect of different T.koningii treatments on crude fat content in S.japonica seeds

2.3 不同浸種時(shí)間對(duì)國(guó)槐種子內(nèi)抗氧化酶活性的影響

在國(guó)槐種子中保護(hù)酶活性測(cè)定中，不同質(zhì)量濃度康寧霉素處理后種子內(nèi)各抗氧化酶活性不同，且不同階段下的變化規(guī)律也不同，如圖 6～8所示。

圖6 不同康寧霉素處理對(duì)國(guó)槐種子中POD活性的影響Fig.6 Effect of different T.koningii treatments on POD activity in S.japonica seeds

圖7 不同康寧霉素處理對(duì)國(guó)槐種子中CAT活性的影響Fig.7 Effect of different T.koningii treatments on CAT activity in S.japonica seeds

圖8 不同康寧霉素處理對(duì)國(guó)槐種子中SOD比活性的變化Fig.8 Effect of different T.koningii treatments on SOD speci fi c activity in S.japonica seeds

由圖 6～8可知，在浸種過程中，國(guó)槐種子內(nèi)過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性變化不明顯，且各質(zhì)量濃度之間差異不顯著(p＞0.05)。整體上，在康寧霉素300～0.3mg/L的范圍內(nèi)呈增加趨勢(shì)，比對(duì)照的酶活性要高，在0.3～0.003mg/L的范圍內(nèi)POD、CAT、SOD比活性又呈下降趨勢(shì)。在發(fā)芽第7天和第14天時(shí)，POD、CAT、SOD比活性最大出現(xiàn)在0.3mg/L，在此質(zhì)量濃度下與對(duì)照相比，差異顯著(p＜0.05)。此時(shí)康寧霉素在300～0.3mg/L的范圍內(nèi)，隨著康寧霉素質(zhì)量濃度的降低，國(guó)槐種子內(nèi)的保護(hù)酶活性隨之升高，當(dāng)康寧霉素質(zhì)量濃度到達(dá)0.3mg/L時(shí)，國(guó)槐種子內(nèi)的保護(hù)酶活性到達(dá)最大。另外，在康寧霉素質(zhì)量濃度為300mg/L時(shí)，其種子內(nèi)POD、SOD比活性比對(duì)照低。說明，康寧霉素在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可以提高酶的活性，也可以降低其活性。

3 結(jié)論與討論

魏林[15]等用哈茨木霉T2-16代謝產(chǎn)物對(duì)花生種子浸種處理后，發(fā)現(xiàn)其降低了種子外滲液的相對(duì)電導(dǎo)率，可能是因?yàn)闇p少或修復(fù)了細(xì)胞膜的損傷，改變了種子膜磷脂的物理狀態(tài)，限制了過多的水分進(jìn)入種子，這樣減小了對(duì)種子細(xì)胞膜造成的損傷，有利于保持細(xì)胞膜的完整性，減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的外滲。劉登望[16]等用哈茨木霉拌種使花生蛋白質(zhì)含量、亞油酸含量增加，油分含量增幅較大。POD、PPO、SOD均為植物細(xì)胞內(nèi)清除活性氧傷害的保護(hù)酶，其活性的提高有助于提高植物的抗病性[17]。SOD是生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的清除劑，能有效地防止它們對(duì)生物體的損害，幾乎參與了生物體對(duì)各種逆境的生理生化反應(yīng)，是生物體內(nèi)一種很重要的抗氧化酶類[18]。魏林[19]等應(yīng)用哈茨木霉T2-16菌株發(fā)酵產(chǎn)物，對(duì)豇豆種子進(jìn)行浸種處理，分析了發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)種子萌發(fā)過程中主要生理生化過程的影響。結(jié)果表明，該發(fā)酵產(chǎn)物可增強(qiáng)豇豆體內(nèi) SOD、CAT、POD等保護(hù)酶活性。

本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果具有一致性?？祵幟顾靥幚韲?guó)槐種子后，其電導(dǎo)率發(fā)生了變化，種子內(nèi)各種有機(jī)物質(zhì)也出現(xiàn)不同程度的降低與升高。這說明使用康寧霉素對(duì)國(guó)槐種子進(jìn)行浸種處理，在一定時(shí)間和質(zhì)量濃度范圍內(nèi)保留了種子內(nèi)大部分的物質(zhì)，減少了種子內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的外滲，降低了種子的電導(dǎo)率，使大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠用于種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，康寧霉素在浸種24h時(shí)，可以極大地降低種子的電導(dǎo)率，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性以及防止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的外滲，并且以康寧霉素質(zhì)量濃度為0.3mg/L的處理效果最好。另外，其浸種過程中種子內(nèi)保護(hù)酶活性的變化不是很明顯，但在萌發(fā)過程中國(guó)槐種子種保護(hù)酶的活性顯著提高。這說明康寧霉素可以提高國(guó)槐種子中保護(hù)酶的活性，進(jìn)而提高國(guó)槐種子在萌發(fā)過程中的抗病性，其機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

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