張 宇，黃國(guó)弟，唐志鵬，李劍雄

(1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001； 2.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.北京市陶然亭公園管理處，北京 100050)

芒果Mangifera indica L.為漆樹(shù)科Anacardiaceae植物，該科約有70屬650種常綠或落葉喬木，原產(chǎn)亞洲東南部的熱帶地區(qū)[1]。從世界范圍來(lái)看，芒果栽培區(qū)域北至我國(guó)四川攀西地區(qū)和日本南部島嶼，南至非洲南部，橫跨于南、北緯30度之間。在我國(guó)范圍內(nèi)，芒果在臺(tái)灣省南部、福建的福州以南、廣東(除北部山區(qū)外)、海南省、廣西的百色至梧州一線以南、云南的南部和西南部以及北部的元謀至四川西昌以南的河谷地區(qū)均有分布[2]。芒果新品種的選育是推動(dòng)芒果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，但由于芒果高度異花授粉，高度雜合，遺傳背景基礎(chǔ)復(fù)雜，常規(guī)方法如雜交和實(shí)生選種存在占地面積大、選擇概率低、成本費(fèi)用高等問(wèn)題[2]。分子生物技術(shù)克服了傳統(tǒng)的常規(guī)雜交、實(shí)生選種等研究方法的缺陷。而獲得高質(zhì)量的DNA是對(duì)芒果開(kāi)展基因分析和品種鑒定等生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)。目前對(duì)芒果進(jìn)行分子生物學(xué)研究的報(bào)道不少，如Souza利用RAPD標(biāo)記技術(shù)鑒定了42份芒果資源的起源地[3]，Rajwanna等也選用RAPD標(biāo)記對(duì)25份芒果資源進(jìn)行遺傳多樣性分析[4]，應(yīng)東山選取ISSR、AFLP組合標(biāo)記分析78份芒果資源親緣關(guān)系[5]，房志超等選用ISSR標(biāo)記分析了66份芒果資源的性狀及遺傳關(guān)系[6]，黃麗芳選用微衛(wèi)星SSR標(biāo)記對(duì)116份芒果砧木種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析[7]，但較詳盡獲得芒果總DNA提取方法的報(bào)道不多。本文旨在通過(guò)研究獲得提取高質(zhì)量芒果總DNA的方法，為分子標(biāo)記輔助選擇在芒果育種中得到實(shí)際應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料包括紫花芒、四川紅芒、實(shí)生種、臺(tái)農(nóng)1號(hào)、金穗芒、金煌芒、四季蜜芒、桂熱82、 凱特芒、愛(ài)文芒、紅芒6號(hào)等11個(gè)芒果品種，芒果的嫩紅色葉片均采自廣西大學(xué)標(biāo)本園。分別收集上述品種的葉片各10片，放進(jìn)冰盒內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室，洗凈后選用雙蒸水清潔葉片并濾干水分，放入-20℃低溫冰箱內(nèi)待用[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取液

提 取 液(1)SDS液：4％SDS，pH 7.8的 110mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，0.5mol/L NaCl，3％β-巰基乙醇，4％PVP；提取液(2)氯仿/異戊醇(24∶1)；提取液(3)TE高鹽：0.8mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA；提取液(4)TE：10mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA；提取液(5)CTAB液(一)：3％的CTAB，pH7.8的100mmol/L Tris-HCl，25mmol/L EDTA，1.5mol/L NaCl；提取液(6)CTAB液(二)：3％的CTAB，pH7.8的100mmol/L Tris-HCl，25mmol/L EDTA，1.5mol/L NaCl，3％的β-巰基乙醇。

1.2.2 DNA提取步驟

SDS法：參考王家保等人的方法[10]，選0.6g鮮樣，液氮中研磨成粉末，放入10ml離心管并加入65℃預(yù)熱的提取液(1)5ml混合，65℃中30min水浴；放入同體積的提取液(2)搖勻，常溫11 000r/min，12min離心；在清液中兌入1/10體積5mol/L NaAc與2.5倍體積無(wú)水乙醇，-30℃冰箱中放30min，在4℃下11 000r/min 12min離心；留沉淀用75％酒精洗2遍并風(fēng)干之后用提取液(3)溶解；加入 RNase使?jié)舛葹?0μg/μL，37℃保持30min；加同體積的提取液(2)混合，在4℃下11 000r/min離心12min；選清液加入-30℃預(yù)冷的2倍體積無(wú)水乙醇，-30℃沉淀DNA 30min，然后4℃，11 000r/min離心12min；留沉淀75％酒精洗沉淀2遍并風(fēng)干，然后選100μLTE試劑放入提取液(4)溶解，-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CTAB法：參考朱炳耀等人的方法[11-12]，選0.6g鮮樣，液氮中研磨成粉末，放入10ml離心管；加入65℃預(yù)熱提取液(5)4ml搖勻，65℃中30min水?。环湃胪w積的提取液(2)搖勻，常溫下11 000r/min 12min離心；選清液，加1/10體積5mol/L NaAc與2.5倍體積無(wú)水乙醇，置冰箱-30℃下沉淀DNA 30min，4℃下11 000r/min離心12min；選沉淀，75％酒精洗沉淀2次，自然風(fēng)干，用提取液(4)溶解；-30℃下保存。

改良CTAB法：參考文獻(xiàn)[13]中的方法，并稍做了修改，取0.5g鮮樣，液氮中研磨成粉末，放入10ml離心管；放入65℃預(yù)熱的4mL提取液(6)搖勻，65℃水浴60min，間隔12min混動(dòng)1次離心管；放入同體積的提取液(2)搖勻，常溫中12 000r/min離心12min；留清液，加1/10體積5mol/L NaAc與2.5倍體積無(wú)水乙醇，沉淀DNA。4℃，12 000r/min，離心12min；留沉淀，選75％酒精凈化沉淀3次，風(fēng)干后用提取液(3)500μL溶解；加入 RNase使?jié)舛葹?0μg/μL，37℃中恒溫30min；放入同體積的氯仿/異戊醇(24∶1)搖勻，4℃，12 000r/min，離心12min；留上清加同體積的-30℃預(yù)冷的異丙醇，-25℃下沉淀DNA30min，4℃，12 000r/min離心12min；留沉淀，用75％酒精凈化沉淀2遍，風(fēng)干并用100μL提取液(4)溶解，-25℃保存。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)及濃度調(diào)整

通過(guò)紫外分光光度計(jì)、凝膠瓊脂糖電泳和ISSR擴(kuò)增檢測(cè)DNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定230nm、260nm及280nm的吸光值，依據(jù)OD260計(jì)算DNA濃度，1OD等于50μg/ml雙鏈DNA，空白為TE溶液，依據(jù)260nm的吸光值分別與280nm和230nm的吸光值的比值OD260/280和OD260/230計(jì)算DNA純度；通過(guò)凝膠瓊脂糖電泳，吸取7μL稀釋20倍的DNA，用1％瓊脂糖凝膠，110 V恒壓電泳，EB染色、紫外自動(dòng)成像儀照相觀察。參考胡尚力等[14]的方法進(jìn)行ISSR檢測(cè)，芒果ISSR反應(yīng)體系為20μL，含 10×PCR Buffer 2.0μL，10mmol/L 的 dNTPs混合液0.5μL，10mmol/L的引物0.4μL。 1.25 U的含 Mg2+Taq DNA 聚合酶 0.2μL，30ng/μL ddH2O 15.9μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，退火1min(不同引物的退火溫度不同)，72℃延長(zhǎng)1min，39個(gè)循環(huán)；72℃再延長(zhǎng)8min；10℃保存。用UBC-857 ISSR引物檢驗(yàn)不同DNA模板的PCR效果，產(chǎn)物在1.8％凝膠瓊脂糖跑帶后于紫外成像儀下觀察效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

用3種方法提取DNA的結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，3種方法均可有效獲取芒果總DNA，但在純度和產(chǎn)率上有差異。采用SDS法和改良CTAB法提取的芒果總DNA，其OD260/280比值分別在1.77～1.88和1.81～1.87區(qū)間內(nèi)，表明蛋白質(zhì)和RNA等大分子物質(zhì)被去除的比較干凈，DNA純度較高；CTAB法的OD260/280比值在2.01～2.11的區(qū)間內(nèi)，比值大于1.9，說(shuō)明仍有RNA等大分子殘留沒(méi)有除凈；改良CTAB法的OD260/230比值在2.01～2.09的區(qū)間內(nèi)，SDS法OD260/230和CTAB法OD260/230比值分別在1.57～1.95和1.82～1.92區(qū)間內(nèi)，表明改良CTAB法去除小分子、鹽和酚類物質(zhì)等雜質(zhì)的能力比SDS法和CTAB法更徹底。就總DNA的得率而言，CTAB法獲取總DNA得率最高，SDS法獲取總DNA得率最低。雖然用改良CTAB法提取DNA的得率不是最高，但它卻是從芒果嫩葉中提取到符合純度標(biāo)準(zhǔn)的總DNA的較好方法。

表1 3種方法提取DNA的結(jié)果比較?Table 1 Comparison of three DNA extraction methods

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

將提取的DNA稀釋20倍，取7μL進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，由CTAB法獲取的DNA，點(diǎn)樣區(qū)域帶有雜樣，表明有蛋白質(zhì)存留，而且還存在少量的RNA，純度還需精進(jìn)；由SDS法獲取的DNA，點(diǎn)樣區(qū)域存留較多雜樣；由改良CTAB法獲取的DNA，條帶清晰整潔，表明其質(zhì)量較高，可用于開(kāi)展后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.3 ISSR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

以分別用SDS法、CTAB法和改良CTAB法獲取的總DNA為模板，用UBC-857進(jìn)行ISSRPCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，SDS法和CTAB法獲取的總DNA進(jìn)行ISSR-PCR缺帶現(xiàn)象比較嚴(yán)重，尤其是SDS法擴(kuò)增出的條帶彌散，不能用于ISSR分析；選用改良CTAB法獲取總DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增的結(jié)果具有豐富的多態(tài)性，條帶清晰，適合數(shù)理分析。對(duì)3種提取總DNA的方法進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示改良CTAB法提取總DNA的效果最好。

圖1 三種方法提取DNA的結(jié)果比較Fig.1 Comparison of three DNA extraction methods

圖2 三種方法獲取DNA模板的ISSR-PCR電泳圖Fig.2 ISSR-PCR electrophoresis results of the DNA templates extracted by three methods

3 討論與結(jié)論

糖類、酚類、蛋白質(zhì)、單寧及色素等代謝物質(zhì)是影響提取高質(zhì)量總DNA的關(guān)鍵因素。芒果為多年生漆樹(shù)科熱帶常綠果樹(shù)，其葉片中的糖類、酚類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的含量較高，采用普通的CTAB法和SDS法提取的總DNA效果不理想。在液氮研磨中放入PVP可以絡(luò)合酚類物質(zhì)，防止酚類物質(zhì)氧化物成醌類物質(zhì)，引起總DNA氧化褐變；β-巰基乙醇能夠降解蛋白質(zhì)，同時(shí)抑制多種氧化酶的活性；多糖常與總DNA同時(shí)沉淀呈現(xiàn)膠粉現(xiàn)象，影響總DNA純度與后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，CTAB與氯仿/異戊醇(24∶1)提取液抽提可有效沉淀除去多糖[15]。改良CTAB法與CTAB法在液氮研磨樣品過(guò)程中加入PVP充分的絡(luò)合酚類物質(zhì)，改良CTAB法與SDS法，加入了RNA降解酶，較好地排除了RNA干擾。SDS法點(diǎn)樣孔殘留較多的蛋白質(zhì)，CTAB法極少有蛋白質(zhì)殘留，而改良CTAB法沒(méi)有蛋白質(zhì)殘留，這也許是由于65℃時(shí)CTAB與蛋白質(zhì)絡(luò)合，進(jìn)而較好的抑制了多酚氧化酶的活性。雖然結(jié)果顯示總DNA產(chǎn)率最高的不是由改良CTAB法所獲取的，但電泳圖譜顯示改良CTAB法所提取的總DNA電泳譜帶清晰，無(wú)任何雜質(zhì)殘留且譜帶無(wú)拖尾現(xiàn)象。這可能與最終采用異丙醇沉降總DNA有關(guān)，推測(cè)異丙醇比無(wú)水乙醇更能充分的沉淀芒果葉片總DNA。將三種方法提取的總DNA通過(guò)ISSR擴(kuò)增顯示，改良CTAB法提取的總DNA的擴(kuò)增效果圖譜清晰、多態(tài)性高；而CTAB法和SDS法提取總DNA的擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)模糊和缺帶現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)所選用的3種方法都能提取出芒果總DNA，但各種方法提取的總DNA的產(chǎn)量和純度存在差異。其中改良CTAB法能夠較好地除去多糖、多酚及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，提取的DNA純度最高，產(chǎn)量也較理想，可以獲得高質(zhì)量的芒果總DNA，能用于下一步開(kāi)展分子生物學(xué)研究的相關(guān)工作。

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