■劉莉莉 蔣倩倩 李淑蓮 吳 濤 丁常宏 趙 波 郭艷麗 程玉鵬

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

乳脂是牛奶的主要營(yíng)養(yǎng)成分，可以給人們補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和能量，生產(chǎn)具有優(yōu)質(zhì)乳脂組成的牛奶是健康食品的發(fā)展趨勢(shì)。乳脂中約95%的脂類(lèi)為甘油三酯，由超過(guò)400種不同的脂肪酸組成，其中中短鏈脂肪酸(SMCFA)與長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)比例約為40%∶60%(Chilliard等，2000)。乳脂中剩余的5%脂類(lèi)由甘油二酯、單酰甘油、磷脂、膽固醇和游離脂肪酸組成(Jensen等，1991)。乳腺上皮細(xì)胞是乳脂合成的場(chǎng)所，乳腺中從頭合成或外源攝取的脂肪酸與甘油酯化形成甘油三酯后分泌到細(xì)胞外(Mcguire等，2002)。

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)脂肪酸在生命活動(dòng)中具有非常重要的作用，它們不僅是供能物質(zhì)、生物膜的組成部分，而且脂肪酸可通過(guò)細(xì)胞膜受體信號(hào)途徑和轉(zhuǎn)錄因子活化途徑等間接、直接和獨(dú)立地調(diào)控基因的表達(dá)(Georgiadi等，2012；Duplus等，2000；Sampath等，2005)。以往的研究有報(bào)道，短鏈脂肪酸（SCFA）和長(zhǎng)鏈脂肪酸（LCFA）能改變奶牛乳腺上皮細(xì)胞中短鏈脂肪酸從頭合成基因、甘油三酯合成基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因及其它生脂基因的表達(dá)(胡菡等，2010；王紅芳，2011；Yonezawa等，2004；Peterson等，2004)。但中鏈脂肪酸對(duì)奶牛乳腺脂代謝的影響及其相關(guān)機(jī)制目前還不十分清楚，辛酸鈉是是飽和八碳脂肪酸（C8∶0），屬于一種中鏈脂肪酸。本試驗(yàn)擬研究添加辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯合成能力的影響，及辛酸鈉對(duì)GPAM、AGPAT6、LPIN1和DGAT1基因和蛋白表達(dá)的影響，為研究脂肪酸對(duì)奶牛乳脂合成調(diào)控奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)，為反芻動(dòng)物原料乳的優(yōu)化、乳脂肪的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

奶牛乳腺上皮細(xì)胞，辛酸鈉（sigma），DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶（sigma），Trizol（Invitrogen），甘油三酯定量試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR?Primx Ex TaqTM（TaKaRa），Prime ScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa），去除脂肪酸的牛血清白蛋白（sigma），GPAM Antibody(sc-161674)，AGPAT6 Antibody(sc-68594)，LPIN1 Antibody(sc-50050)，DGAT1 Antibody(sc-32861)。

1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)和處理

采用生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%FBS)于37℃，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺上皮細(xì)胞等密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)脂無(wú)血清培養(yǎng)基（DMEM/F12+1 g/l BSA）培養(yǎng)24 h，更換新鮮無(wú)脂無(wú)血清培養(yǎng)基并添加不同濃度的辛酸鈉，辛酸鈉的終濃度分別為0、0.5、1、2 mmol/l，每組3個(gè)平行，培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)基檢測(cè)甘油三酯濃度，收集細(xì)胞用于相關(guān)指標(biāo)的qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)基中甘油三酯濃度的檢測(cè)

采用甘油三酯定量試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液中甘油三酯的濃度。

1.4 引物設(shè)計(jì)

使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)各基因qRT-PCR的上游、下游引物（見(jiàn)表1）。

表1 基因的qRT-PCR引物序列

1.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞總RNA提取、cDNA合成及各基因的qRT-PCR檢測(cè)

用Trizol試劑提取奶牛乳腺上皮細(xì)胞總RNA。按照Prime ScriptTMRT reagent Kit說(shuō)明書(shū)對(duì)RNA逆轉(zhuǎn)錄，使用SYBR?Primx Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行基因的qRT-PCR檢測(cè)。每個(gè)基因進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。各基因的qRT-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCT相對(duì)定量的方法（β-actin基因?yàn)閰⒄栈颍┯?jì)算目的基因的mRNA表達(dá)豐度(Livak等，2001)。

1.6 乳腺上皮細(xì)胞總蛋白提取

用2×SDS上樣緩沖液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，收集并于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western Blotting檢測(cè)

配制濃縮膠和分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，對(duì)膜進(jìn)行脫脂牛奶封閉，一抗、二抗孵育，發(fā)光液顯色，暗室中曝光、顯影。采用Band Scan 5.0軟件對(duì)Western blotting圖譜進(jìn)行灰度掃描，X光膠片上蛋白條帶經(jīng)掃描和Bandscan軟件讀取密度值后，與由同一轉(zhuǎn)移膜所測(cè)得的β-actin蛋白比較得出蛋白的相對(duì)含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛酸鈉對(duì)細(xì)胞合成甘油三酯能力的影響

采用甘油三酯測(cè)試盒檢測(cè)培養(yǎng)基中TAG的濃度，結(jié)果如圖1所示。與未添加辛酸鈉的乳腺上皮細(xì)胞相比，0.5～2 mmol/l的辛酸鈉以濃度依賴的方式顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)基中TAG的濃度（P＜0.05）。

圖1 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞合成TAG能力的影響

2.2 辛酸鈉對(duì)GPAM、AGPAT6、LPIN1和DGAT1基因表達(dá)的影響

采用qRT-PCR檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞GPAM、AGPAT6、LPIN1和DGAT1各基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖2～圖5所示，與未添加辛酸鈉的乳腺上皮細(xì)胞相比，0.5～2 mmol/l的辛酸鈉以濃度依賴的方式降低或顯著降低細(xì)胞GPAM、AGPAT6、DGAT1和LPIN1基因的表達(dá)（P＜0.05）。

圖2 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞GPAM基因表達(dá)的影響

圖3 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞AGPAT6基因表達(dá)的影響

圖4 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞LPIN1基因表達(dá)的影響

圖5 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞DGAT1基因表達(dá)的影響

2.3 辛酸鈉對(duì)GPAM、AGPAT6、DGAT1和LPIN1蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞GPAM、AGPAT6、DGAT1和LPIN1各蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖6～圖10所示。

圖6 辛酸鈉處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞GPAM、AGPAT6、LPIN1和DGAT1蛋白表達(dá)的Western blotting結(jié)果

與未添加辛酸鈉的乳腺上皮細(xì)胞相比，0.5～2 mmol/l辛酸鈉以濃度依賴的方式降低或顯著降低細(xì)胞GPAM、AGPAT6、DGAT1和LPIN1的蛋白表達(dá)（P＜0.05）。

圖7 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞GPAM蛋白表達(dá)的影響

圖8 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞AGPAT6蛋白表達(dá)的影響

圖9 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞LPIN1蛋白表達(dá)的影響

圖10 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞DGAT1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

甘油三酯在乳腺上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）上合成。來(lái)自從頭合成途徑的脂酰輔酶A和外源攝取的FA被酯化到甘油-3-磷酸骨架上以形成TAG(Li，2012)。甘油-3-磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶（GPAM）、乙酰甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶6（AGPAT6）、磷脂酸磷酸酯酶1（LPIN1）、二酰甘油脂酰轉(zhuǎn)移酶1（DGAT1）等參與催化甘油三酯的合成(Coleman等，2004)，這些酶也是乳腺中參與脂肪合成的關(guān)鍵酶(Bionaz等，2008)。GPAM能催化脂酰輔酶A結(jié)合到甘油-3-磷酸的sn-1位形成溶血磷脂酸(LPA)。AGPAT催化第二個(gè)脂酰輔酶A結(jié)合到sn-2位合成磷脂酸(PA)。PA磷酸水解酶lipin(LPIN)能轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)，將PA轉(zhuǎn)變成二酰甘油（DAG）。最后，另一個(gè)脂酰輔酶A酯化到甘油骨架的sn-3位合成甘油三酯。DGAT位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，對(duì)于甘油三酯合成來(lái)說(shuō)它是一種特殊的酶，DGAT被認(rèn)為可能也是甘油三酯合成的限速酶(Mayorek等，1989)。Bionaz等(2008)認(rèn)為與其他TAG合成的基因相比，DGAT1在乳脂合成過(guò)程中起次要作用，但對(duì)增加乳中TAG也起關(guān)鍵作用。AGPAT6和LPIN1是牛乳腺組織中各自基因家族內(nèi)的主要亞型。奶牛乳腺組織中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到DGAT2 mRNA表達(dá)，DGAT1的相對(duì)mRNA豐度比DGAT2高(Peterson等，2004)。

近些年有研究報(bào)道辛酸鹽能抑制脂肪細(xì)胞甘油三酯合成及抑制生脂基因的表達(dá)。Guo等(2003)用辛酸鹽處理小鼠脂肪細(xì)胞（3T3-L1）和人脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)辛酸鹽能抑制細(xì)胞中TAG的合成，介導(dǎo)抑制1,2-二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的活性，還會(huì)降低細(xì)胞中DGAT、ACC和SCD-1的mRNA表達(dá)水平。Guo等(2006)研究還發(fā)現(xiàn)辛酸鹽能降低3T3-L1細(xì)胞中脂肪酸合成酶（FAS）、分化抗原簇36(CD36)、脂蛋白脂肪酶（LPL）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體δ（PPARδ）、PPARγ和DGAT2基因的表達(dá)。Han等研究發(fā)現(xiàn)辛酸鹽抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的脂肪生成，可能由于辛酸鹽能明顯降低細(xì)胞中關(guān)鍵生脂基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PPARγ、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）和CCAAT元件結(jié)合蛋白（C/EBPα）基因的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)所致(Han等，2002)。這些研究表明辛酸鹽能參與脂肪細(xì)胞的脂肪合成，并調(diào)節(jié)相關(guān)生脂基因的表達(dá)。然而，辛酸鹽對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成的影響卻不清楚。

本研究檢測(cè)了不同濃度辛酸鈉處理的奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯的合成能力，及參與甘油三酯合成的關(guān)鍵酶GPAM、AGPAT6、LPIN1和DGAT1的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的變化。結(jié)果表明添加0.5～2 mmol/l的辛酸鈉能以濃度依賴的方式顯著降低細(xì)胞TAG的合成，并能降低或者顯著降低GPAM、AGPAT6、LPIN1和DGAT1的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)，說(shuō)明辛酸鹽能負(fù)向調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而阻止脂酰輔酶A酯化到甘油-3-磷酸骨架上，最終會(huì)影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯的合成。這與前人用辛酸鹽對(duì)其他細(xì)胞脂肪合成影響的研究基本一致。本研究推測(cè)中鏈脂肪酸辛酸鹽在一定程度上負(fù)向調(diào)控奶牛乳腺乳脂的合成，為研究脂肪酸對(duì)奶牛乳脂合成調(diào)控奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)，為反芻動(dòng)物原料乳的優(yōu)化、乳脂肪的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控等提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究表明，辛酸鈉（0.5～2.0 mmol/l）能以濃度依賴方式抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯的合成，并能抑制甘油三酯合成的關(guān)鍵酶甘油-3-磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶（GPAM）、乙酰甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶6（AGPAT6）、二酰甘油脂酰轉(zhuǎn)移酶1（DGAT1）和磷脂酸磷酸酯酶1（LPIN1）的表達(dá)，證實(shí)辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂肪合成具有一定的調(diào)節(jié)作用。

（參考文獻(xiàn)19篇，刊略，需者可函索）