■王化勇 馬澤芳 崔 凱 史雪萍 劉成功 梁俊文

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.山東省榮成市成功種貂養(yǎng)殖廠，山東威海 264306；3.山東省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東濟(jì)南 250022）

銅是動(dòng)物體內(nèi)必需的微量礦物元素，而高銅對(duì)于提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、消化酶活性、超氧化物歧化酶、血液SOD、血漿銅藍(lán)蛋白等含銅輔酶的活性均有促進(jìn)作用[1-2]，因此，在畜禽生產(chǎn)中高劑量銅作為促生長(zhǎng)劑被廣泛利用。水貂是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的珍貴毛皮動(dòng)物，銅作為飼料添加劑促進(jìn)水貂生長(zhǎng)發(fā)育的研究?jī)H見Aulerich(1976)的報(bào)道，即銅添加量為200 mg/kg時(shí)，對(duì)水貂的體重沒有明顯有利或不利的影響，并且指出水貂對(duì)銅的最大耐受量要高于200 mg/kg[3]，但是更高劑量銅對(duì)水貂生長(zhǎng)發(fā)育和血液生化指標(biāo)的影響以及銅的最高添加量等方面的研究還未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以蛋氨酸螯合銅為銅源，在水貂基礎(chǔ)飼糧中添加210～300 mg/kg的銅，通過飼養(yǎng)試驗(yàn)和消化代謝試驗(yàn)研究飼糧中添加高劑量銅對(duì)水貂生長(zhǎng)性能指標(biāo)、消化代謝率和血液生化指標(biāo)的影響，探討銅的最高添加量，為水貂飼料生產(chǎn)和配制提供營(yíng)養(yǎng)學(xué)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

血清堿式磷酸酶（AKP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、銅藍(lán)蛋白(CER)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD)總蛋白（TP）試劑盒，南京建成生物工程研究所；

蛋氨酸螯合銅，飼料級(jí)，含銅17%，吉林特產(chǎn)研究所提供；

移液槍，10～100 μl,20～200 μl,100～1 000 μl，德國(guó)Eppendorf公司；

VARIAN SpectrAA-240原子吸收光譜儀,湖北鼎龍科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；

電子分析天平，ACCULAB,奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；

低速離心機(jī)，DL-4000B；上海安亭科學(xué)儀器廠；

紫外可見分光光度計(jì)，UV-1100，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

糞尿收集設(shè)備，自制。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

試驗(yàn)動(dòng)物為(86±5)日齡，平均體重(1.42±0.04)kg的健康雄性美國(guó)短毛黑水貂，共70只，隨機(jī)平均分成7組（對(duì)照組、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組），每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只。

1.3 試驗(yàn)飼糧及營(yíng)養(yǎng)水平

試驗(yàn)飼糧由基礎(chǔ)飼糧和蛋氨酸螯合銅組成?；A(chǔ)飼糧由海雜魚、雞肝、雞小胃、膨化玉米以及由礦物質(zhì)、維生素等組成的添加劑配制而成，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

蛋氨酸螯合銅分為 0、210、220、230、240、250、300 mg/kg 7個(gè)水平，分別添加到7個(gè)組（對(duì)照組、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組）的基礎(chǔ)飼糧中，配制成試驗(yàn)日糧。

1.4 飼養(yǎng)試驗(yàn)

飼養(yǎng)試驗(yàn)于2010年7月25日～11月12日進(jìn)行，試驗(yàn)期110 d。在常規(guī)條件下采用單籠飼養(yǎng)，籠子尺寸為70 cm（長(zhǎng)）×35 cm（寬）×35 cm（高）。由固定人員進(jìn)行專門飼養(yǎng)，每天早、晚各飼喂一次，自由飲水。試驗(yàn)過程中記錄每只水貂每天的飼料采食量，從86日齡起，每間隔15 d，即101、116、131、146、161、176、196日齡時(shí)于早飼前稱重并記錄，計(jì)算平均日采食量及平均日增重。

表1 育成期基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.5 消化代謝試驗(yàn)

飼養(yǎng)試驗(yàn)過程中于8月21、22、23日，10月20、21、22日采用全收糞尿法分別收集糞樣和尿樣。每天8：00全量收集并測(cè)定糞、尿量，鮮糞稱重后取樣品100 g裝入封口袋中，加入10 ml 10%硫酸溶液進(jìn)行固氮，尿液測(cè)量體積后取樣品100 ml，加入2 ml的10%硫酸溶液裝入收集瓶中，均于-20℃儲(chǔ)存。

1.6 血樣的采集

8月24日采用剪趾法進(jìn)行第一次采血，11月12日在飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束，水貂屠宰打皮時(shí)采用心臟采血法進(jìn)行第2次采血，每只采集5 ml，凝血后3 500 r/min離心10 min，分離血清樣品,并分裝于Eppendorf管中于-80℃冰箱保存。

1.7 測(cè)定指標(biāo)與測(cè)定方法

飼料及糞中銅使用VARIAN SpectrAA-240原子吸收光譜儀進(jìn)行測(cè)定，粗蛋白、粗脂肪及尿氮按照《飼料分析與飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》（張麗英第三版）[5]中所述方法于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定。

血清ALT、AKP、CER、Cu-Zn-SOD、TP采用考馬斯亮藍(lán)法及比色法測(cè)定，按照試劑盒說明書操作，在UV-1100紫外可見分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度。

各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

平均日增重（ADG，g/d）=（試驗(yàn)?zāi)w重-試驗(yàn)初體重）/試驗(yàn)天數(shù)；

料重比（F/G）=平均日采食量/平均日增重；

脂肪消化率（FD，%）=（食入脂肪-糞排出脂肪）/食入脂肪×100。

氮沉積（NR，g）=食入氮-糞氮-尿氮；

氮表觀消化率（ND，%）=（食入氮-糞排出氮）/食入氮×100；

凈蛋白質(zhì)利用率（NPU，%）=（食入氮-糞排出氮-尿排出氮）/食入氮×100；

氮生物學(xué)價(jià)值（BV，%）=（食入氮-糞排出氮-尿排出氮）/（食入氮-糞排出氮）×100。

Cu（μg/g）=C×V×D/W（C——由儀表直接讀出的銅濃度；V——樣品待測(cè)溶液體積；D——稀釋倍數(shù)；W——樣品質(zhì)量）。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0中的單因素方差分析進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SE)表示，其中以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 86～196日齡水貂體重、平均日增重及生長(zhǎng)曲線

86～196日齡水貂體重、平均日增重測(cè)定統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，生長(zhǎng)曲線見圖1。

圖1 86～196日齡水貂生長(zhǎng)曲線

由圖1和表2可知，6個(gè)試驗(yàn)組各日齡體重均高于對(duì)照組相應(yīng)日齡體重，其中Ⅳ組各日齡體重均高于其他各組相應(yīng)日齡體重。隨著飼糧銅水平的提高，各組水貂平均日增重呈先升高后降低的趨勢(shì)，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組水貂平均日增重均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），Ⅳ組水貂平均日增重極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），顯著高于其他各試驗(yàn)組（P＜0.05），Ⅴ組、Ⅵ組平均日增重高于對(duì)照組，但是差異不顯著（P＞0.05）。

表2 86～196日齡水貂體重、平均日增重測(cè)定結(jié)果

2.2 飼糧銅水平對(duì)水貂料重比影響的測(cè)定結(jié)果（見表3）

由表3可見，各試驗(yàn)組平均日采食量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），各試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05）；各試驗(yàn)組料重比均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）低于對(duì)照組，且隨著銅添加量的提高，呈先下降后升高的趨勢(shì)，銅添加量為240 mg/kg（Ⅳ組）時(shí)，料重比達(dá)到最低。

2.3 飼糧銅水平對(duì)水貂脂肪消化率影響的測(cè)定結(jié)果(見表4)

由表4可知，試驗(yàn)組脂肪日食入量、脂肪日排出量均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，組間差異不顯著(P＞0.05)；Ⅰ～Ⅴ組脂肪代謝率顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，組間差異不顯著，Ⅵ組脂肪代謝率與對(duì)照組差異不顯著。

表3 86～196日齡水貂料重比測(cè)定結(jié)果

表4 86～196日齡水貂脂肪消化率的測(cè)定結(jié)果

2.4 飼糧銅水平對(duì)水貂氮代謝影響的測(cè)定結(jié)果(見表5)

由表5可知，Ⅰ～Ⅳ組水貂氮消化率高于對(duì)照組，差異不顯著(P＞0.05)，Ⅴ組、Ⅵ組水貂氮消化率低于對(duì)照組，差異不顯著(P＞0.05)；Ⅰ～Ⅳ組水貂氮沉積指標(biāo)比對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），Ⅴ組、Ⅵ組水貂氮沉積指標(biāo)高于對(duì)照組，但差異并不顯著(P＞0.05)；試驗(yàn)組凈蛋白質(zhì)利用率和氮生物學(xué)價(jià)值均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

以上指標(biāo)，各試驗(yàn)組間差異都不顯著，但均以Ⅳ組（240 mg/kg）數(shù)值為最高。

2.5 飼糧銅水平對(duì)水貂血清酶活性影響的測(cè)定結(jié)果(見表6)

由表6可知，各試驗(yàn)組AKP活性與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)；Ⅰ～Ⅳ組ALT活性與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)，Ⅴ組、Ⅵ組ALT活性顯著高于對(duì)照組和Ⅲ組、Ⅳ組(P＜0.05)；隨著銅添加量的增加，各處理組Cu-Zn-SOD活性及CER含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中Ⅳ組的數(shù)據(jù)顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)高于其他各組；Ⅳ組TP含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，其他各處理組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表5 86～196日齡水貂氮消化率、凈蛋白利用率和氮生物學(xué)效價(jià)的測(cè)定結(jié)果

表6 水貂血清酶活性的測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 飼糧銅水平對(duì)水貂生長(zhǎng)發(fā)育的影響

趙麗等[6]研究發(fā)現(xiàn)飼糧銅含量為100、200 mg/kg時(shí)，能顯著促進(jìn)雛鴨的生長(zhǎng)發(fā)育；李宏等[7]研究發(fā)現(xiàn)，高銅日糧對(duì)兔的促生長(zhǎng)作用是明顯的，可提高其日增重，說明高銅飼糧對(duì)動(dòng)物有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。從本試驗(yàn)結(jié)果可知，210～240 mg/kg處理組水貂平均日增重均顯著高于對(duì)照組，且隨著銅添加量的提高，平均日增重呈升高的趨勢(shì)，當(dāng)添加到240 mg/kg時(shí)達(dá)到極顯著水平，這與以上研究結(jié)果一致，說明飼糧中添加高劑量銅能夠顯著提高育成期水貂的生長(zhǎng)性能，且240 mg/kg水平的銅添加量作用最顯著。

程忠剛等[8]研究表明，飼糧添加高銅可顯著提高仔豬粗脂肪的表觀消化率；Braude等和Lucss等報(bào)道，飼糧添加適宜的銅提高了青年豬氮消化率和沉積率[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明210～240 mg/kg的銅能顯著提高水貂的脂肪消化率、氮沉積、凈蛋白利用率和氮生物學(xué)效價(jià)，說明高銅能夠促進(jìn)育成期水貂的消化代謝率，從而提高其生長(zhǎng)性能，這與以上研究結(jié)果相一致。

雖然高銅對(duì)動(dòng)物有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，但是過量的銅會(huì)對(duì)組織器官造成病理?yè)p傷。彭西等[10]研究報(bào)道日糧銅水平過高時(shí)，對(duì)雛雞消化道、腎、肝、心臟等器官造成不同程度的病理?yè)p傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，銅添加量250～300 mg/kg時(shí)水貂平均日增重呈降低的趨勢(shì)，脂肪消化率、氮沉積、凈蛋白利用率和氮生物學(xué)效價(jià)也開始下降，原因可能是250 mg/kg的添加量已經(jīng)超過了育成期雄性水貂銅的最高添加量，對(duì)水貂機(jī)體造成了損傷，降低其消化代謝率，進(jìn)而降低了促生長(zhǎng)作用。

3.2 飼糧銅水平對(duì)水貂血液生化指標(biāo)的影響

ALT是廣泛存在于動(dòng)物組織細(xì)胞內(nèi)線粒體中重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，在正常情況下血清中含量甚微，但當(dāng)肝臟發(fā)生病理?yè)p傷時(shí)，組織內(nèi)的ALT釋放入血液而致血清ALT升高。因此，血清ALT活性的高低可反映出機(jī)體在高銅狀況下肝臟的病理?yè)p傷程度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示210～240 mg/kg處理組ALT活性與未添加銅處理組差異不顯著，但是250 mg/kg及300 mg/kg處理組ALT活性顯著高于未添加銅處理組，說明250 mg/kg以上的銅已經(jīng)對(duì)水貂肝臟造成損傷。Aulerich和Powell（1982、1997）各自研究表明，用添加200 mg/kg銅的日糧飼喂水貂357 d和140 d后，并沒有對(duì)其產(chǎn)生毒性作用，并指出育成期水貂對(duì)銅的最大耐受量要高于200 mg/kg[4,11]，這與本研究結(jié)果相符合，說明240 mg/kg已達(dá)到育成期雄性水貂飼糧中銅的最大添加量，超過這個(gè)量會(huì)對(duì)水貂肝臟造成損傷。

日糧銅水平的變化可導(dǎo)致含銅酶活性的變化，當(dāng)機(jī)體缺銅時(shí)，機(jī)體內(nèi)含銅酶的活性降低，當(dāng)補(bǔ)飼銅后，含銅酶活性升高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示在210～240 mg/kg范圍內(nèi)，各組CuZn-SOD及銅藍(lán)蛋白活性均顯著、極顯著高于未添加銅處理組，且隨著銅添加量的提高呈上升的趨勢(shì)，這與張?zhí)K江等[12]報(bào)道飼糧中添加高銅能明顯提高生長(zhǎng)豬血清含銅酶銅藍(lán)蛋白和CuZn-SOD活性的結(jié)果相一致，說明高銅對(duì)育成期水貂血清中CuZn-SOD及銅藍(lán)蛋白的活性有明顯的促進(jìn)作用。而超過240 mg/kg后CuZn-SOD及CER活性開始下降，這與朱奎成等（2007）報(bào)道雛雞血清銅藍(lán)蛋白活性隨日糧銅水平的增加而增強(qiáng)，但是達(dá)到500 mg/kg時(shí)，銅藍(lán)蛋白活性下降[13]的結(jié)果一致，說明240 mg/kg的添加量已達(dá)到育成期水貂的適宜添加量，超過這個(gè)量將對(duì)水貂肝臟造成損傷，導(dǎo)致肝臟合成CER的能力下降，Cu-Zn-SOD活性降低。

各處理組AKP活性以及TP含量與未添加銅處理組差異不顯著，說明210～300 mg/kg添加量的銅對(duì)育成期水貂AKP活性以及血清TP含量沒有顯著影響。

4 結(jié)論

育成期雄性水貂飼糧（含銅23.54～26.68 mg/kg）中添加210～240 mg/kg水平的銅可明顯促進(jìn)水貂的生長(zhǎng)發(fā)育，提高血液含銅酶活性，且以240 mg/kg時(shí)作用最為顯著，但超過240 mg/kg時(shí)可對(duì)水貂機(jī)體造成損傷并降低促生長(zhǎng)作用。