林峰，趙博光，王華光

(1．南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心，江蘇南京 210037;2．南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇南京 210037;3．南京林業(yè)大學(xué)機械電子工程學(xué)院，江蘇南京 210037)

擬松材線蟲Bursaphelenchus mucronatus的致病性問題一直存在爭議，目前主要存在3種觀點:一是認為擬松材線蟲不致病或致病力極弱［1－3］，即松樹體內(nèi)存在一定數(shù)量的擬松材線蟲，也不會對松樹的生長產(chǎn)生影響;二是認為擬松材線蟲有潛在或有一定的致病力［4－11］，即在松樹健康的情況下，擬松材線蟲無致病力;當(dāng)樹勢衰退或是環(huán)境條件惡劣時，將會導(dǎo)致松萎蔫的發(fā)生;三是認定擬松材線蟲具致病性［12－13］，會導(dǎo)致松樹萎蔫。以上研究都是采用林間的實地調(diào)查、或?qū)⒉煌瑏碓吹囊吧鷶M松材線蟲人工接種到松屬植物，觀察病狀而得出的結(jié)果。其它關(guān)于擬松材線蟲的研究，則集中在其種下分類、形態(tài)、分子鑒定尤其是與松材線蟲的區(qū)別鑒定等方面［14－16］，這些研究均未對擬松材線蟲致病性的根源進行探究。迄今為止，素有松樹“癌癥”之稱的松萎蔫病已經(jīng)給我國的森林生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴重損失，可危害36種松屬植物和8種非松屬植物［17］。如果擬松材線蟲存在潛在的致病性，應(yīng)盡早引起關(guān)注，以免對業(yè)已脆弱的松林生態(tài)系統(tǒng)造成更大的危害。筆者借鑒了趙博光等［18］研究松材線蟲攜帶的細菌及其致病性的方法，收集了俄羅斯、江西、四川的3個擬松材線蟲蟲株，從其體表攜帶的細菌入手，分離并鑒定了不同來源蟲株攜帶的優(yōu)勢細菌種類，并對這些細菌進行了生物毒性測定和室外接種，旨在分析擬松材線蟲引起松樹不同程度萎蔫的原因。

1 材料與方法

1.1 擬松材線蟲及其攜帶細菌的獲得

1.1.1 擬松材線蟲的來源 俄羅斯的E2，由俄羅斯國家科學(xué)院Dr.O.Klunich提供;四川的樣品SC，由四川省森林病蟲防治檢疫總站陳小平提供，來自四川省瀘州縣;江西的樣品JX2，來自江西省景德鎮(zhèn)。

1.1.2 擬松材線蟲野外接種與分離 采用貝曼漏斗法分離，挑取50條雌雄成蟲放在長滿灰葡萄孢Botrytis cinerea的PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d之后分離線蟲，將擬松材線蟲調(diào)制成2500條/mL的濃度，對3年生黑松Pinus thunbergii野外接種。每株樹接種2 mL，設(shè)6個重復(fù)。3個月后分離線蟲。

1.1.3 擬松材線蟲攜帶細菌的分離 取接種線蟲3個月后的木塊，70%酒精消毒、去樹皮，切成小木塊(0.8 cm×0.4 cm×0.1 cm)放入裝有NA培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)的培養(yǎng)皿中，1～3 d沿線蟲爬行的痕跡挑取單一菌落，純化。

1.2 致病性測定

1.2.1 細菌菌株致病性測定 將1.1.3獲得的各細菌菌株活化、離心10 min(4000 r/min)，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾即得細菌無細胞濾液。將黑松苗(6～8 cm)切根，浸泡在細菌無細胞濾液中，置于26℃恒溫箱中，每天光照12 h。逐天觀察記錄各黑松切根苗的枯萎情況，并將浸泡＜4，4～8，＞8 d的黑松苗達到4級傷害的分成“強致萎活性菌”、“弱致萎活性菌”和“無致萎活性菌”。

1.2.2 細菌菌株的鑒定

1.2.2.1 API自動鑒定系統(tǒng)的鑒定 按照革蘭氏染色、氧化酶反應(yīng)以及過氧化氫酶的測定結(jié)果選取不同的試劑條，采用API自動鑒定系統(tǒng)(ATB Expression生物一梅里埃Bio-Merieux公司)鑒定細菌的種類。挑取斜面菌苔，用2 mL的生理鹽水制成菌懸液，在ATB濁度計中調(diào)整至一定濁度，根據(jù)不同的試條要求，加入相應(yīng)培養(yǎng)基或試劑后，混勻，將一定量的混合液加入試條的各反應(yīng)孔中，加蓋，30℃下培養(yǎng)24 h或48 h，用ATB儀自動檢測生長情況，計算機通過ATB Plus等軟件分析得到相應(yīng)結(jié)果。

1.2.2.2 分子鑒定 選取5個代表菌株進行16S rDNA PCR擴增和測序。

DNA提取:菌株用NB(營養(yǎng)肉湯)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，12 000 r/min離心收集菌體，用10 mmol/L Tris-HCl洗滌3次，溶菌酶破壁，蛋白酶處理，再用酚/氯仿/異戊醇抽提，乙醇沉淀，風(fēng)干，最后溶于TE緩沖液(10 mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.6)中。

16S rDNA的擴增:PCR反應(yīng)的引物為細菌16S rDNA 全長通用引物，8f，CAC GGA TCC AGA GTT TGA T(C/T)(A/C)TGG CTC AG;和1510r，GTG AAG CTT ACG G(C/T)T ACC TTGTTA CGA CTT。反應(yīng)液的配置:總體積 50 μL;EX.Taq(5 U/μL)0.25 μL;10 × Ex.Taq buffer 5 μL;MgCl2(25 min)4 μL;Dntp mixture(2.5 mm)4 μL;模版DNA 2.5 ng(0.5 ～5 ng) 約 4 μL;上游引物(50 μm)0.5 μL;下游引物(50 μm)0.5 μL;剩余體積以滅菌雙蒸水補足。PCR的反應(yīng)條件:94℃，5 min;94℃，30 s;50℃，1 min;72℃，1.5 min;72℃，5 min，循環(huán)30次，變性、解鏈、延伸;反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)有溴化乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其純化根據(jù)膠回收試劑盒(TAKARA公司)的操作說明進行。

16S rDNA克隆及插入子的檢測:PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體的連接，以及感受態(tài)細胞(大腸桿菌)的制備及轉(zhuǎn)化，按分子克隆常規(guī)方法進行。在含有氨芐青霉素(0.5 μg/mL)抗性平板上培養(yǎng)、挑取陽性克隆。陽性克隆再用M13f和M13r引物進行PCR反應(yīng)，以檢測插入子的正確性，反應(yīng)條件:94℃，5 min;94 ℃，30 s;50 ℃，1 min;72 ℃，1.5 min;72℃，5 min;循環(huán)30次，變性、解鏈、延伸。

PCR產(chǎn)物的RFLP圖譜分析:將PCR反應(yīng)檢測獲得的陽性克隆產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶EcoR I及HindⅢ進行酶切分析。質(zhì)粒雙酶切體系為:EcoRⅠ0.8 μL，Hind Ⅲ 0.8 μL，10 × M buffer 2 μL，質(zhì)粒5 μL，37 ℃，2 h，加 2 μL loading buffer至管中，混勻終止反應(yīng)，產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖電泳檢測。

陽性克隆序列分析:每個菌株各挑選1個陽性克隆進行測序分析，登陸NCBI網(wǎng)站(美國國立生物技術(shù)中心網(wǎng)站)，使用 BLAST在GenBank，EMBL，DDBJ以及PDB基因庫中進行序列同源性比較。所得結(jié)果中在相似性最高的幾個菌株中比較。

1.2.3 對3年生黑松進行野外接種 將1.1.2獲得的線蟲與1.1.3分離到的細菌分別配置成不同處理對3年生黑松進行野外接種。處理為:擬松材線蟲(Bm)、無菌擬松材線蟲(ABm)、ABm+細菌菌株E25混合液、ABm+細菌菌株SC7混合液、細菌菌株E25，SC7菌液。接種方法如下:選擇直徑為3～5 mm的側(cè)枝，75%酒精擦拭表面，以滅菌剪刀剪去芽和針葉，斜切枝條頂部，迅速插入已剪去底部的塑料離心管，以封口膜包扎。接種量2 mL(線蟲液0.5 mL+細菌液1.5 mL)，線蟲濃度2500條/mL，細菌液濃度為107cfu/mL。每個處理設(shè)6個重復(fù)。設(shè)NB為對照1(CK1)、生理鹽水(0.85%)為對照2(CK2)。接種3個月后分離并記錄病狀，鑒定分離到的線蟲和細菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌鑒定及其致病性生測結(jié)果

2.1.1 細菌的自動化鑒定結(jié)果及致病性 由表1、圖1可見，擬松材線蟲體表分離到的細菌一共28株:其中魯氏不動桿菌 Acinetobacter 1woffii最多(10株)，占到所有細菌的36%;其次是嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila(4株)、赫氏埃希菌Escherichia hermannii(4株)，其余10個菌株包括耳葡萄球菌Staphylococcus auricularis(3株)、泛菌某些種Pantoeu agglomerans(2株)、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa(2株)、陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae(2株)、熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens(1株)。細菌無細胞濾液對黑松切根苗的生測結(jié)果為:強致萎活性菌、弱致萎活性菌、無致萎活性菌分別有10，15，3株。此外，滅菌生理鹽水和NB 2種對照對黑松切根苗均無致萎作用，在處理9 d后，松苗把水和NB吸干以后，才慢慢枯萎。

表1 擬松材線蟲攜帶的細菌及其致萎性

圖1 擬松材線蟲體表細菌種類占比

2.1.2 代表菌株的分子鑒定結(jié)果

2.1.2.1 PCR擴增和測序 以強致萎活性菌SC5，SC7，E211和非強致萎活性菌E25，JX23為代表菌株和參比菌株大腸桿菌的基因組 DNA為模板，用細菌16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。供試的5菌株都得到一條大小約為1500 bp的特異性條帶(圖2)。圖2中1－5編號為:E25魯氏不動桿菌株1572 bp，E211綠膿假單胞菌株1577 bp，SC5嗜水氣單胞菌株1582 bp，SC7熒光假單胞菌株1580 bp，JX23泛菌某些種菌株1584 bp。

圖2 細菌16S rDNA PCR擴增后產(chǎn)物電泳圖

2.1.2.2 Blast比對結(jié)果 SC5，SC7，E211，E25，JX23的16S rDNA序列遞交給GeneBank(NCBI)數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源序列檢索，從結(jié)果中選取具有代表性的菌株。比對結(jié)果如下:E25魯氏不動桿菌的基因序列與BLAST顯示的100個序列均有98%以上的同源性，與約翰遜不動桿菌Acinetobacter johnsonii最接近。E211銅綠假單胞菌基因序列與BLAST顯示的112個序列均有99%以上的同源性，其中除未培養(yǎng)細菌(比例為9%)外，都為假單胞科或假單胞屬細菌，其中有26個為惡臭假單胞。因此認為E211菌株是惡臭假單胞Pseudomonas putida，SC5嗜水氣單胞菌基因序列與BLAST顯示的117個序列均有98%以上的同源性，其中除未培養(yǎng)細菌(占10.3%)外，都為氣單胞屬細菌，其中有27個為嗜水氣單胞菌。因此SC5菌株與機器鑒定結(jié)果完全吻合，為嗜水氣單胞菌。SC7熒光假單胞菌基因序列與BLAST顯示的105個序列有98%以上同源性，其中除未培養(yǎng)細菌外，都為假單胞屬細菌，其中有3個為熒光假單胞菌，7個為惡臭假單胞。由于分值最高的兩位為熒光假單胞，故認為該菌株與機器鑒定結(jié)果完全一致，為熒光假單胞。JX23泛菌某些種基因序列與BLAST顯示的90個序列均有96%以上的同源性，其中除了未培養(yǎng)細菌(41.7%)外，有31個歐文氏屬 Erwinia，14個泛菌屬細菌。分值最高的前10位均為歐文氏屬，因而認為該菌株與機器鑒定不相符。菌株JX23是歐文氏菌Erwinia cypripedii。

2.2 3年生黑松野外接種結(jié)果 不同接種體接種發(fā)病情況有明顯差異(表2)，強致萎性細菌SC7單獨接種、無菌擬松材線蟲、2種對照接種黑松均不發(fā)病;野生擬松材線蟲SC蟲株、無菌擬松材線蟲分別與強致萎性細菌SC7混合接種發(fā)病嚴重，3個月內(nèi)發(fā)病率分別達到100%和92%。SC蟲株體表分離到的9個細菌菌株中，有5個為強致萎性細菌，因此野生擬松材線蟲比無菌擬松材線蟲+單獨1種強致萎性細菌混合接種發(fā)病率更高。無致萎性細菌E25單獨接種及其與無菌擬松材線蟲混合接種都顯現(xiàn)出輕微的病狀，發(fā)病率分別是14%和17%。接種的擬松材線蟲均在3個月后分離到。

表2 不同接種體接種3年生黑松苗的發(fā)病情況

3 結(jié)論與討論

(1)細菌分離與鑒定。在細菌分離時，為保證試驗的代表性，將同一樣品中具有相同菌落形態(tài)特征的編為1個號，在一定程度上人為降低了細菌重復(fù)出現(xiàn)的幾率［19］，同時，為了排除人工培養(yǎng)后線蟲沾染雜菌，采用了接種再分離的方法。本試驗中，最初每個線蟲樣品各任意挑取細菌菌株30個，經(jīng)3次純化后進行形態(tài)觀察，從每個蟲株上各挑取12個菌株進行機器鑒定，其中8個菌株未能鑒定出結(jié)果，而鑒定出的28個細菌菌株具有一定的代表性。此外，為了明確細菌的分類地位，本文還選了5個代表菌株進行了16S rDNA PCR擴增和測序，為后續(xù)的生測做準(zhǔn)備。

從細菌分離結(jié)果來看，擬松材線蟲攜帶的優(yōu)勢菌為魯氏不動桿菌、嗜水氣單胞菌、赫氏埃希菌。從SC和E2蟲株分離到的細菌種類可以看出，擬松材線蟲體表攜帶的細菌與地區(qū)關(guān)系不大。關(guān)于擬松材線蟲攜帶的細菌報道較少，賁愛玲［20］從中國擬松材線蟲體表分離到食酸叢毛單胞菌Comamonas acidovorans。Tian 等［21］報道了變形菌(Alphaproteobacteria)為擬松材線蟲體表的優(yōu)勢菌。可以看出，擬松材線蟲體表攜帶的細菌種類比較復(fù)雜，相對于松材線蟲，其體表攜帶的細菌數(shù)目少［20，22］。

(2)黑松切根苗生測與室外接種結(jié)果。研究松材線蟲攜帶的細菌與松萎蔫病的關(guān)系一般多采用無菌苗作為生測材料［23］。高蓉［24］、梁波［25］等對這種生測材料進行了對比并進行了改良，將黑松切根苗作為生測材料。本研究采用梁波［25］的生測方法，對擬松材線蟲體上分離到的28個菌株進行了毒性測定。結(jié)果表明，同一個擬松材線蟲蟲株上有可能同時攜帶強致萎性細菌、弱致萎性細菌及無致萎性細菌。從本文來看，SC蟲株攜帶的強致萎性細菌比例最高，E2蟲株次之，而JX2沒有攜帶強致萎性細菌。在強致萎性細菌中，僅包含以下幾種細菌(出現(xiàn)頻率從高到底):嗜水氣單胞菌、魯氏不動桿菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌。而假單胞菌被視為松材線蟲體表的主要致病細菌［17，20，26－28］。由此可見，雖然擬松材線蟲與松材線蟲都攜帶假單胞菌，但是可能由于前者攜帶的致病細菌比后者少，因此其致病性在不同地區(qū)和不同生態(tài)環(huán)境下表現(xiàn)不同，尚未對松林造成巨大的損失。

3年生黑松野外接種試驗表明，強致萎性細菌單獨接種黑松不發(fā)病，無菌線蟲單獨接種也不發(fā)病，兩者混合接種病情嚴重，說明擬松材線蟲引起的松萎蔫病是線蟲與細菌復(fù)合侵染的結(jié)果。無致萎性細菌E25單獨及其與無菌線蟲溫合接種輕微發(fā)病，很可能是在野外接種中無菌線蟲感染了致病菌所致［17，29］。Tian［21］證明野生型線蟲可以產(chǎn)生比無菌線蟲更多的后代，從而推測細菌可以促進擬松材線蟲的發(fā)育、傳播和發(fā)展。筆者也曾報道過松材線蟲與其攜帶的某些致病菌會相互促進繁殖［30－31］，松材線蟲與其攜帶的致病菌是長期進化過程中形成的互惠共生關(guān)系，而與弱致病菌及無致病菌不能相互促進繁殖，這一結(jié)果解釋了為什么松材線蟲在一些地區(qū)發(fā)病嚴重，而在另一些地區(qū)并不發(fā)病這一現(xiàn)象。

本文首次系統(tǒng)地分離了幾種來源的擬松材線蟲體表攜帶的細菌，生測了其致病性，指出擬松材線蟲引起的松萎蔫病是線蟲與細菌復(fù)合侵染的結(jié)果，為該病在防治上提供了病理學(xué)基礎(chǔ)。

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