馬 丹，郭 玫，王志旺，劉雪楓，王瑞瓊

（甘肅中醫(yī)學院藥學系，蘭州730000）

唐古特大黃（Rheum.tanguticum Maxim.ex Balf.，RT）和掌葉大黃（Rheum palmatum L.，RP）均為 2010版《中國藥典》收載的供藥用的大黃［1］，其中RT主產于青海南部、甘肅南部和西藏偏東部［2，3］，西寧為其主要集散地。RP主產于甘肅東南部、四川西北部及西藏東南部。近年來RT的需求量穩(wěn)步增加，為了發(fā)揮我國RT藥材資源的優(yōu)勢，地處道地產區(qū)的甘南州建設了唐古特大黃GMP種植基地。本研究組在大黃“瀉下攻積”功效的指導下，對比考察了甘南栽培RT、西寧栽培RT與甘肅禮縣栽培RP的瀉下作用，為甘南栽培RT的臨床應用與出口評價提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

復方地芬諾酯片，批準文號：H45020028，廣西河豐藥業(yè)有限責任公司生產，批號：130401；Na＋-K＋-ATP酶，南京建成生物工程研究所生產，生產批號：20140302；其余試劑為分析純。甘南栽培唐古特大黃（RT-GN）、西寧栽培唐古特大黃（RT-XN）與禮縣栽培掌葉大黃（RP-LX），人工栽培，第4年10月份采挖；經本校楊扶德教授鑒定；整形后縱切成厚片，陰干，粉碎即得生大黃粗粉。稱取生大黃粗粉15 g，加蒸餾水100 ml，常溫（20～24）℃浸泡 2.5 h后用武火煮開，文火煎煮10 min，過濾，得濾液約 30～35 ml，加 12.5 ml碳素墨汁，定容至50 ml，即得含生大黃、碳素墨汁分別為30%與25%的藥液。另取蒸餾水加25%的碳素墨汁即得空白對照液，取上述藥液用空白對照液稀釋3倍即得含生大黃、碳素墨汁分別為10%與25%的藥液。上述受試藥冷藏，24 h內使用。

1.2 儀器

TGL-16G高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠生產；BS1103 sartorius電子天平，北京賽多里斯有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市正基儀器有限公司生產；722型分光光度計，上海第三分析儀器廠生產。

1.3 實驗動物與分組

KM小鼠，SPF級，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證號SCXK（甘）2011-0001。SPF級實驗室，許可證號為SYXK（甘）2011－0001。取小鼠按性別體重分層隨機分為8組，每組隨機分為A、B、C三小組（n＝12）。

1.4 小鼠便秘模型的復制與給藥

小鼠禁食不禁水8 h后，灌胃復方地芬諾酯50 mg／kg［4］，正常對照組蒸餾水灌胃20 ml／kg。造模1 h后，灌胃給藥RTGN（6.0 g／kg、2.0 g／kg）、RT-XN（6.0 g／kg、2.0 g／kg）、RP-LX（6.0 g／kg、2.0 g／kg），正常對照組與模型對照組空白對照液灌胃 20 ml／kg。

1.5 觀察指標

1.5.1 大黃對便秘小鼠的排便時間及次數(shù) A組小鼠給藥后分籠飼養(yǎng)，觀察小鼠首次排出黑便的時間及5 h內的排便次數(shù)。

1.5.2 大黃對便秘小鼠腸道含水量的影響 B組小鼠給藥1 h后脫頸椎處死，打開腹腔，結扎幽門下端與直腸末端，雙向結扎回盲部，分離腸系膜，取出自幽門至回盲部的小腸以及自回盲部至直腸末端的大腸，稱取濕重后將其置于56℃烘箱，干燥至衡重后稱取干重，計算腸道的含水量腸道含水量（%）＝（濕重-干重）／濕重×100%。

1.5.3 大黃對便秘小鼠結腸Na＋-K＋-ATP酶活性影響 C組小鼠給藥1 h后脫頸椎處死，打開腹腔，立即從回盲部下端開始剪取結腸，用預冷的生理鹽水洗凈糞便與血液，濾紙吸取多余水分，稱取0.2 g制備10%的均漿，1 000 r／min離心10 min，取結腸均漿上清液按試劑盒說明書測定Na＋-K＋-ATP酶的活性。組織中Na＋-K＋-ATP酶活力計算公式：ATP酶活力（U／mg）＝｛［（A測定管－A對照管）÷A標準管］×標準管濃度×反應體系中樣品稀釋倍數(shù)×6｝÷蛋白含量

1.6 統(tǒng)計學的處理方法

2 結果

2.1 便秘小鼠的排便時間及次數(shù)

灌服復方地芬諾酯后，小鼠首次排出黑便的時間延長，5 h內排便次數(shù)減少，與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明便秘小鼠模型復制成功；經三種大黃干預后，小鼠首次排出黑便的時間縮短，5 h內排便次數(shù)明顯增多，與模型對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。與相同劑量禮縣栽培掌葉大黃比較，甘南栽培唐古特大黃與西寧栽培唐古特大黃的瀉下作用更強（表1）。

Tab.1 Comparative study on purgative effect of RT-GN in costive mice（，n＝12）

Tab.1 Comparative study on purgative effect of RT-GN in costive mice（，n＝12）

**P＜0.01 vs control group； ＃＃P＜0.01 vs model group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs RT-XN group

Group Dosage sg／kg Time of defecate in 5 hour Control - 116.3±28.3 4.9±1.8 Model - 240.4±30.6** 1.8±0.6**RP-LX High 6.0 202.0±29.9＃＃ 4.8±2.0＃＃RP-LX Low 2.0 211.5±32.3 3.6±1.6＃＃RT-GN High 6.0 176.9±31.0＃＃ 8.9±2.4＃?！鳌鱎T-GN Low 2.0 181.4±35.0＃＃△ 9.0±3.8＃?！鳌鱎T-XN High 6.0 178.7±33.0＃＃ 7.3±1.4＃?！鳌鱎T-XN Low 2.0 182.6±30.7＃＃△ 7.7±2.6＃＃latency（min） Defecate time△△

2.2 便秘小鼠腸道含水量的變化

小鼠給予止瀉藥后，小腸濕重、小腸與大腸的含水量明顯減少，與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。經受試藥干預后，甘南栽培唐古特大黃高劑量與西寧栽培唐古特大黃高劑量對便秘小鼠小腸濕重、小腸含水量有一定的提高作用（P＜0.05）。對大腸含水量，三種大黃均有顯著的增加作用（P＜0.01），其中甘南栽培唐古特大黃與西寧栽培唐古特大黃的作用比禮縣栽培掌葉大黃的作用更強（P＜0.01）；同時，實驗數(shù)據顯示甘南栽培唐古特大黃與西寧栽培唐古特大黃的作用顯示出了一定的量效關系（P＜0.05）。由于大便的排泄對小鼠大腸干重的影響比較大，因此大腸干重、大腸濕重的組間差異沒有實際意義（表2）。

2.3 便秘小鼠結腸Na-K-ATP酶活性的變化

模型對照組小鼠結腸Na＋-K＋-ATP酶的活性有所提高，與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。經藥物干預后，三種大黃可明顯抑制小鼠結腸Na＋-K＋-ATP酶的活性，與模型對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），且顯示出一定的量效關系。與相同劑量禮縣栽培掌葉大黃組比較，甘南栽培唐古特大黃與西寧栽培唐古特大黃的抑制作用更強（P＜0.05，表 3）。

Tab.2 Comparative study on small intestine’s and large intestine’s moisture content of RT-GN（，n＝12）

Tab.2 Comparative study on small intestine’s and large intestine’s moisture content of RT-GN（，n＝12）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group；△△P＜0.01 vs RT-XN group；▲P＜0.05 vs RTGN group

Group Dosage（g／kg ）Small intestine Wet weight（mg）dry weight（mg）Moisture content（%）Large intestine Wet weight（mg）dry weight（mg）Moisture content（%）Control - 1818.9±114.4 756.8±40.3 78.8±1.3 1257.9±140.6 658.8±35.7 77.7±1.4 Model - 1711.7±101.3*767.7±34.9 77.0±1.3* 1179.2±122.4 682.7±28.3 72.3±2.1**RP-LX High 6.0 1758.1±168.7 784.5±50.6 77.6±1.6 1280.0±275.6 667.7±50.0 77.6±2.5＃＃RP-LX Low 2.0 1724.8±205.9 776.6±77.2 77.5±1.4 1399.5±128.8 708.0±59.2 76.8±1.5＃＃RT-GN High 6.0 1877.7±222.8＃771.0±41.2 79.1±2.8＃ 1313.8±151.6 653.4±66.1 82.1±1.8＃?！鳌鱎T-GN Low 2.0 1743.3±199.0 784.5±71.4 77.3±1.4 1451.0±179.7 689.2±66.8 80.2±1.5＃?！鳌鱎T-XN High 6.0 1865.8±196.4＃794.0±51.0 81.1±6.7＃ 1209.2±103.0 628.5±28.9 82.4±2.8＃＃△△▲RT-XN Low 2.0 1732.2±270.7 769.6±56.0 78.4±3.3 1389.4±170.8 676.4±61.5 79.8±2.6＃?！鳌鳌?/p>

Tab.3 Comparative study on the colon’s Na／K ATPase of RT-GN in costive mice（，n＝12）

Tab.3 Comparative study on the colon’s Na／K ATPase of RT-GN in costive mice（，n＝12）

*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group；△P＜0.05 vs RT-LX group

Group Dosage（g／kg） Na＋／K＋ ATPase（U／mg ）Control - 5.166±0.559 Model - 5.710±0.581*RP-LX High 6.0 4.108±0.479＃＃RP-LX Low 2.0 4.571±0.503＃RT-GN High 6.0 3.607±0.448＃?！鱎T-GN Low 2.0 4.006±0.458＃?！鱎T-XN High 6.0 3.646±0.452＃?！鱎T-XN Low 2.0 4.024±0.461＃＃△

3 討論

唐古特大黃作為大黃的優(yōu)質品種之一，國內使用與作為商品出口的需求量很大；為了發(fā)展生產、保護環(huán)境，大黃原產地的各省區(qū)相繼建立了一批大黃生產基地，如四川的南川、甘肅的禮縣、宕縣等地，但從現(xiàn)有的基地布局來看，公認的唐古特大黃地道產區(qū)—青海南部、西藏偏東部、甘肅南部一帶的生產基地發(fā)展緩慢，商品生產仍是以野生來源為主。因此，為保證我國唐古特大黃藥材資源的優(yōu)勢，加快優(yōu)質大黃產區(qū)的基地建設，甘南州建設了一批唐古特大黃生產基地。為了考察甘南州GMP基地所產唐古特大黃的質量，本研究組就甘南栽培唐古特大黃與西寧栽培唐古特大黃、甘肅禮縣栽培掌葉大黃的有效成分、主要藥理作用展開研究，為甘南州栽培唐古特大黃的臨床應用與出口評價提供理論依據。

本次研究在大黃“瀉下攻積，主治實熱積滯便秘”的中醫(yī)藥理論指導下，通過灌胃復方地芬諾酯來復制便秘動物模型，觀測甘南栽培唐古特大黃的瀉下作用及其機制。實驗結果顯示，甘南栽培唐古特大黃、西寧栽培唐古特大黃及禮縣栽培掌葉大黃具有明顯的瀉下作用，可縮短排便時間，增加排便次數(shù)。抑制腸道對水分的吸收、增加腸內容物的體積而刺激腸壁，使腸蠕動加快是瀉下藥作用機制之一［5］；實驗結果顯示，抑制結腸腸壁Na＋-K＋-ATP酶的活性而抑制腸道對水分的吸收是大黃瀉下作用機制之一。本次實驗結果顯示，唐古特大黃的瀉下作用及對腸肌Na＋-K＋-ATP酶和腸道水分吸收的抑制作用明顯強于掌葉大黃，這與以前的研究相一致［6］；實驗過程中發(fā)現(xiàn)，甘南栽培唐古特大黃與西寧栽培唐古特大黃的瀉下作用及對腸肌Na＋-K＋-ATP酶和腸道水分吸收的抑制作用無明顯差異。

總之，甘南栽培唐古特大黃有明顯的瀉下作用，其瀉下強度與西寧栽培唐古特大黃無明顯差異，而明顯優(yōu)于禮縣栽培掌葉大黃；抑制結腸Na＋-K＋-ATP酶而抑制腸道水分的吸收是甘南栽培唐古特大黃瀉下機制之一。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：22.

［2］ 焦東海，杜上鑒.大黃研究［M］.上海：上?？茖W技術出版社，2000：115.

［3］ 王 巖，宋良科，王小寧，等.大黃種質考證與資源分布［J］.中國藥房，2013，24（11）：1040.

［4］ 李會芳，王伽伯，曲 毅，等.大黃炮制前后致瀉效價的比較［J］.中國中藥雜志，2012，37（3）：302.

［5］ 侯家玉.中藥藥理學［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2012：141.

［6］ 王家葵，李 傲，王 慧，等.正品大黃不同品種間瀉下效價強度比較研究［J］.中國中藥雜志，2006，31（23）：1987.