低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIFs）是低氧信號(hào)調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子，由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成，其中α亞基對(duì)氧濃度敏感，是低氧調(diào)節(jié)中起主要作用的亞基，而β亞基對(duì)氧濃度不敏感［1］。目前發(fā)現(xiàn)的HIFs家族有三個(gè)成員：HIF-1、HIF-2和 HIF-3，研究表明在 HIF-1α氨基酸序列ODD域（氧依賴降解結(jié)構(gòu)域）中，含有兩個(gè)脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain proteins，PHD）羥化位點(diǎn)，其保守基序?yàn)長(zhǎng)XXLAP（其中X為任意氨基酸），而在C-TAD域（羧基端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)）中第851位為天冬氨基酸殘基，該位點(diǎn)與HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，是保守氨基酸［2］。Ema［3］等在研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)調(diào)控時(shí)首次報(bào)道 HIF-2α，HIF-2α又稱(chēng)為內(nèi)皮 PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1（endothelial PASdomain protein-1，EPAS-1），與 HIF-1α同源性最高，也是細(xì)胞低氧應(yīng)答反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子。

青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)裸鯉），屬硬骨魚(yú)綱鯉形目（Cypriniforms），鯉科（Cyprinidae），裂腹魚(yú)亞科（Schizothoracinae），裸鯉屬（Gymnocypris），僅分布在中國(guó)青海湖及其水系，是青海湖中唯一的水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，又稱(chēng)之為“湟魚(yú)”，2004年在《中國(guó)物種紅色名錄》中列為瀕危物種。

本文通過(guò)克隆青海湖裸鯉HIF-2α基因序列并對(duì)其ODD功能域進(jìn)行羥化分析，為進(jìn)一步研究青海湖裸鯉適應(yīng)高原鹽堿湖低氧環(huán)境的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物材料 青海湖裸鯉樣本從青海湖入湖河流捕獲，取肝臟組織用于研究，樣品保存于RNAlater液體中。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScript Reverse Transcriptase、Ribonuclease Inhibitor、rTaq酶購(gòu)自 TaKaRa公司，Transtaq酶購(gòu)自TransGen公司，限制性內(nèi)切酶、未預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自 Thermo公司，Glutathione Resin購(gòu)自 GenScript公司，GSTTag Mouse mAb購(gòu)自Abmart公司，預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自New England Biolabs公司，Trx-Tag Monoclonal Antibady購(gòu)自 Novagen公司，Goat Anti-Mous IgG、Goat Anti-Rabbit IgG、硝酸纖維素薄膜購(gòu)自 Boster公司，Western blot一抗二抗去除液、BeyoECL Plus購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，引物合成及序列測(cè)定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 從GenBank中尋找鯉科魚(yú)類(lèi)HIF-2α基因序列，比對(duì)分析相關(guān)序列，根據(jù)序列保守區(qū)利用Oligo 7設(shè)計(jì)相關(guān)引物；通過(guò)裸鯉測(cè)序結(jié)果再設(shè)計(jì)其ODD功能域特異性引物（表 1）。

Tab.1Sequences of primers

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裸鯉cDNA的合成和裸鯉HIF-2α基因序列擴(kuò)增 參照RNAiso Plus總RNA提取試劑說(shuō)明操作，提取裸鯉肝臟組織總RNA；參照 PrimeScript Reverse Transcriptase說(shuō)明操作，以oligo dT（RT-PCR）或接頭引物 GR3AD（3’RACE）將總 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于HIF-2α基因序列擴(kuò)增。PCR總體積25μl，其中 10×Tans Taq buffer 2.5μl，Tans Taq（5 U／μl）0.15μl，dNTP（2.5 mmol／L）2μl，上下游引物各 1μl，cDNA 1μl，用雙蒸水補(bǔ)齊。擴(kuò)增條件：94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，割膠回收目的條帶，測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 序列生物信息學(xué)分析 應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中HIF-2α序列分析其保守結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Clusta W2，DNAMAN和Mega 6等軟件對(duì)青海湖裸鯉HIF-2α序列進(jìn)行比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.3 裸鯉HIF-2αODD功能域擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增青海湖裸鯉HIF-2αODD功能域，SalⅠ和NotⅠ雙酶切，構(gòu)建pGEX-4T-2-ODD原核表達(dá)載體，測(cè)序驗(yàn)證。將pGEX-4T-2-ODD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta中，陽(yáng)性鑒定后直接用于表達(dá)或加甘油保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 裸鯉HIF-2αODD功能域羥化作用分析 培養(yǎng)200 ml pGEX-4T-2-ODD表 達(dá) 細(xì) 胞，isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside（IPTG）誘導(dǎo)，超聲波破碎，離心后取上清，各加入50μl GST Resin，4℃孵育 3 h，離心回收柱子。用結(jié)合液（20 mmol／L Tris（pH 8.0），100 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，0.5%NP-40）將柱子洗脫兩次，棄上清。再用反應(yīng)緩沖液（20 mmol／L Tris（pH 7.5），5 mmol／L KCl，1.5 mmol／L MgCl2）洗滌三次。用一定量反應(yīng)緩沖液將沉淀重新懸浮，平均分裝成兩管，一管為對(duì)照組，另一個(gè)管實(shí)驗(yàn)組。每管各加入500μl反應(yīng)液（含有100 μmol／L 2-酮戊二酸，100μmol／L-抗壞血酸，50μmol／L FeCl2，100μmol／L二硫蘇糖醇的反應(yīng)緩沖液），混合均勻，30℃預(yù)熱5 min。向?qū)嶒?yàn)組加入500μl純化并透析過(guò)的斑馬魚(yú)PHD3蛋白（本實(shí)驗(yàn)室制備），對(duì)照組加入等體積的反應(yīng)液，混合均勻，30℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)完全后，將樣品在4℃條件下，10，000 r／min離心5 min，棄上清。再用預(yù)冷1×PBS緩沖液洗滌三次，棄上清。最后用50μl 10 mmol／L還原性谷胱甘肽洗脫液洗脫目的蛋白，收集上清。取30μl上清，進(jìn)行蛋白變性處理，Western blot檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 裸鯉HIF-2α基因序列的擴(kuò)增

根據(jù)其它鯉科魚(yú)類(lèi)HIF-2α基因?qū)Ρ确治?，通過(guò)HIF-2α基因序列保守序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行基因擴(kuò)增，獲得單一擴(kuò)增條帶（圖1-A）。根據(jù)裸鯉HIF-2α基因序列已知片段，對(duì)HIF-2α基因3’端序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行基因擴(kuò)增，獲得較單一擴(kuò)增條帶（圖 1-B）。

2.2 裸鯉HIF-2α基因序列及氨基酸序列分析

裸鯉 HIF-2α擴(kuò)增長(zhǎng)度為 3 013 bp，利用 NCBI的 ORF Finder程序?qū)π蛄凶鲩_(kāi)放性閱讀框分析，經(jīng)分析其開(kāi)放閱讀框（ORF）分別為2 502 bp，分別編碼833個(gè)氨基酸（GenBank登錄號(hào)為KJ921650）。將裸鯉HIF-2α氨基酸序列與斑馬魚(yú)、草魚(yú)、胭脂魚(yú)、武昌魚(yú)、人及小鼠的序列進(jìn)行對(duì)比，分析表明其氨基酸全序列一致性分別為：85.22%、88.20%、77.71%、87.25%、55.61%及54.93%。同時(shí)，裸鯉 HIF-2α氨基酸序列與裸鯉HIF-1α具有46%的一致性。在裸鯉HIF-2α中的ODD區(qū)域中，預(yù)測(cè)的脯氨酸羥化位點(diǎn)符合LXXLAP的保守基序（X代表任意氨基酸），而C-TAD區(qū)中羥化酶FIH的作用位點(diǎn)天冬酰胺Asn851同樣保守，表明青海湖裸鯉HIF-2α的氧依賴調(diào)節(jié)途徑可能與其它脊椎動(dòng)物基本相似。

Fig.1 RT-PCR（A）and RACE（B）products of Naked carp hypoxia inducible factor-2α （HIF-2α）resolved by agarose gel electrophoresis

2.3 裸鯉HIF-2αODD功能域蛋白表達(dá)及純化

將含有重組表達(dá)載體pGEX-4T-2-ODD的Rosetta菌株誘導(dǎo)表達(dá)并純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的GST-ODD蛋白大小為35 KD，符合預(yù)期蛋白分子量大小。GST-ODD重組蛋白部分為可溶性表達(dá)，GST resin純化獲得的目的蛋白純度較高（圖2A）。

2.4 Western blot檢測(cè)分析

以與GST resin孵育結(jié)合的GST-ODD重組蛋白作為底物進(jìn)行羥化反應(yīng)，產(chǎn)物洗脫后分別用Anti-GST和Anti-Trx抗體檢測(cè)GST-ODD及Trx-PHD3（圖2B）。GST-ODD實(shí)驗(yàn)組能檢測(cè)到Trx-PHD3的存在，表明GST-ODD能通過(guò)酶／底物相互作用與Trx-PHD3結(jié)合。

Fig.2 SDSPAGE analysis and hydroxylation assay of recombinant GST-ODD

3 討論

HIF-1α和 HIF-2α結(jié)構(gòu)相似，均含有 bHLH、PAS、ODD和TAD區(qū)域。同時(shí)，二者的氧依賴降解途徑也很相似，在常氧條件下，PHDs以氧和α-酮戊二酸為底物，將一個(gè)氧原子以羥基的形式對(duì)HIF-αODD區(qū)兩個(gè)保守基序“LXXLAP”中的脯氨酸進(jìn)行羥基化（HIF-1α：P402／P564；HIF-2α：P405／P531），另一個(gè)轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸形成琥珀酸和CO2［4］。羥化的 HIF-α隨后被pVHL識(shí)別并由泛肽標(biāo)記，進(jìn)入蛋白降解途徑。在低氧狀態(tài)下，不發(fā)生脯氨酸羥化反應(yīng)，HIF-α與ARNT形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，與低氧誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子部位的HRE元件結(jié)合，與輔助轉(zhuǎn)錄因子CBP／p300一起促進(jìn)靶基因的表達(dá)。但HIF-1α和HIF-2α使用的羥化酶不同，HIF-1α降解主要依靠PHD2，而HIF-2α降解主要依靠PHD3。

序列分析表明，青海湖裸鯉HIF-1α與HIF-2α氨基酸序列具有約46%的一致性，與哺乳動(dòng)物基本相似，但二者在ODD功能域第二個(gè)Pro羥化基序存在一定的差異。青海湖裸鯉 HIF-1α為 PEMLAP［5］，不符合 LXXLAP保守基序；而青海湖裸鯉 HIF-2α為 LETLAP，與其它脊椎動(dòng)物一樣，符合LXXLAP保守基序。一般認(rèn)為，HIF-1α主要參與對(duì)急性低氧的應(yīng)答，而HIF-2α是慢性低氧或較高海拔低氧的主要調(diào)節(jié)者。我們推測(cè)，在青海湖裸鯉長(zhǎng)期適應(yīng)高原低氧鹽湖環(huán)境過(guò)程中，兩種HIF-α羥化位點(diǎn)的差異可能分別發(fā)揮不同的重要作用。

本實(shí)驗(yàn)成功原核表達(dá)了青海湖裸鯉HIF-2αGST-ODD融合蛋白，通過(guò)PHD3羥化酶處理，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白能通過(guò)酶／底物作用與PHD3結(jié)合，表明GST-ODD蛋白能被PHD3羥化酶識(shí)別并羥化，提示青海湖裸鯉HIF-2α的ODD域沒(méi)有發(fā)生類(lèi)似HIF-1α的羥化位點(diǎn)變異，能夠被PHD3正常識(shí)別并結(jié)合，這為進(jìn)一步研究和比較青海湖裸鯉HIF的調(diào)控機(jī)制及下游靶基因作用機(jī)理，提供一定的分子生物學(xué)依據(jù)。

［1］ Semenza G L.HIF-1：Mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia［J］.J Appl Physiol（1985），2000，88（4）：1474-1480.

［2］ Rahman M S，Thomas P.Molecular cloning，characterization and expression of two hypoxia-inducible factor alpha subunits，HIF-1αand HIF-2α，in a hypoxia-tolerant marine teleost，atlantic croaker［J］.Gene，2007，396（2）：273-282.

［3］ Ema M，Taya S，Yokotani N，et al.A novel bHLH-PASfactor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor 1αregulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（9）：4273-4278.

［4］ Kaelin Jr WG，Ratcliffe P J.Oxygen sensing by metazoans：The central role of the HIF hydroxylase pathway［J］.Mol Cell，2008，30（4）：393-402.

［5］ Cao YB，Chen XQ，Wang S，et al.Evolution and regulation of the downstream gene of hypoxia-inducible factor-1αin naked carp（gymnocypris przewalskii）from Lake Qinghai，China［J］.J Mol Evol，2008，67（5）：570-580.