李俊麗，范琰琰，葉光華，董繆武，林刻智，李 峰，喻林升

（溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，溫州325035）

姜黃素是（curcumin）是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素，其色澤穩(wěn)定且毒性很低，具有抗炎、抗氧化、抗誘變等廣泛的藥理作用［1］。慢性低氧性肺動脈高壓的主要發(fā)病是低氧引起的肺血管重塑，形態(tài)顯示肺動脈平滑肌細(xì)胞增生、血管膠原沉積、管壁增厚，因此，抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞的增生作用，從而逆轉(zhuǎn)肺血管重塑、減輕低氧性肺動脈高壓成為重要的研究課題。本課題組及國內(nèi)部分研究表明姜黃素可以抑制慢性低氧性細(xì)胞凋亡及減少肺血管細(xì)胞增生和管壁重塑［2］。

肺中含肥大細(xì)胞（mast cell，MC）豐富，是 MC的主要棲息地，其分為兩類：一類是僅含類胰蛋白酶（tryptase）的TMC型，另一類是含類胰蛋白酶和類糜蛋白酶（chymase）的TCMC型，低氧刺激肥大細(xì)胞激活并脫顆粒，顆粒中含有大量細(xì)胞因子和酶類，其中類胰蛋白酶、類糜蛋白酶、MMPs、VEGF與低氧下肺血管增生和肺血管重塑有關(guān)［3］。近年來，炎癥以及MC參與形成并維持肺動脈高壓的機(jī)制研究得到廣泛重視［4，5］，本課題組前期研究表明肺肥大細(xì)胞參與慢性低O2高CO2肺小動脈重塑的作用，但姜黃素能否通過MC途徑調(diào)控慢性低O2高CO2性肺血管重塑的作用，國內(nèi)外未見報道。本實(shí)驗(yàn)在以往的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究，姜黃素對慢性低O2高CO2性大鼠肺血管重塑的作用及影響，為臨床防治慢性低O2高CO2性肺動脈高壓提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級SD雄性大鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；兔抗大鼠TBS抗體及SABC試劑盒購自北京中杉金橋，姜黃素購自Sigma公司，其余試劑均為市售分析純。

1.2 肺動脈高壓模型的建立

常壓低O2高CO2艙（長沙華曦電子科技有限公司，YCP系列）內(nèi) O2濃度維持8%～11%，CO2濃度維持3%～5%，溫度20℃～25℃，濕度40%～70%（氧艙內(nèi)多余水蒸汽用無水氯化鈣吸收），每天8 h，每周6 d，連續(xù)4周，其余時間置于同一室內(nèi)飼養(yǎng)。

1.3 分組與處理

從溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購得180～200 g SD雄性大鼠24只，普通清潔級動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)三天，室內(nèi)溫度 20℃～25℃，濕度 40%～70%，隨機(jī)分為四組（n＝6）：Ⅰ組（常氧空白對照組），Ⅱ組（低 O2高 CO2模型組），Ⅲ組（色甘酸鈉對照組），Ⅳ組（姜黃素實(shí)驗(yàn)組）。Ⅰ組常氧下正常飼養(yǎng)四周，后3組動物放入常壓低O2高CO2艙中，Ⅲ組同時給予色甘酸鈉以20 mg／kg體重腹腔注射處理，IV組給予姜黃素混懸液按150 mg／kg體重灌胃處理。

1.4 肺小動脈顯微結(jié)構(gòu)觀察

放血處死大鼠后，取肺葉組織，10%福爾馬林溶液固定，脫水透明，浸蠟包埋，石蠟組織切片（4μm），HE染色后，光鏡下觀察肺細(xì)小血管顯微結(jié)構(gòu)并拍照。每張切片中選取5支直徑100μm～200μm肺動脈，利用圖像分析系統(tǒng)（IPP 6.0）測定肺細(xì)小動脈管壁／管總面積（vessel wall area／total area，WA／TA）、管腔／管總面積（vessel cavity area／total area，EA／TA）。

1.5 肺小動脈電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)

取肺門處肺動脈周圍組織0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm組織塊，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇、丙醇梯度脫水，EPON812包埋，固化，LKBV型超薄切片機(jī)切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，H-600型透射電鏡下觀察肺小動脈壁周圍肥大細(xì)胞及其內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)彈力板、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠原增生情況，并拍照記錄。

1.6 甲苯胺藍(lán)染色肥大細(xì)胞測定

石蠟包埋組織切片（4μm）二甲苯脫蠟酒精梯度水化、甲苯胺藍(lán)染色、脫水、中性樹膠封固。光鏡下觀察，肺細(xì)小血管周圍甲苯胺藍(lán)染色陽性肥大細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取5個含肺細(xì)小動脈高倍鏡視野，計數(shù)個視野中肥大細(xì)胞細(xì)胞數(shù)（the number of mast cell，NMC），肥大細(xì)胞均數(shù)＝每組肥大細(xì)胞總數(shù)／所取視野數(shù)；肥大細(xì)胞脫顆粒率（degranulation rate，DR）＝脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)／肥大細(xì)胞總數(shù)。

1.7 類胰蛋白酶酶（TBS）的免疫組化檢測

石蠟包埋組織切片，脫蠟、水化，常溫下 3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min，微波熱修復(fù)抗原活性，進(jìn)口山羊血清封閉常溫20 min，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素核復(fù)染，陽性細(xì)胞呈棕黃色。每張切片隨機(jī)選取5個含肺細(xì)小動脈高倍鏡視野，計數(shù)個視野中陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺小動脈顯微和超微結(jié)構(gòu)觀察

肺組織經(jīng)HE染色光鏡下觀察，模型組相比正常組肺細(xì)小動脈管壁明顯增厚，平滑肌細(xì)胞增生，內(nèi)彈力板扭曲明顯，管腔狹窄，同時模型組相比WA／TA明顯增高（P＜0.05）、管腔／管總面積（EA／TA）明顯降低（P＜0.05）；電鏡下，正常組血管結(jié)構(gòu)正常，平滑肌細(xì)胞及膠原未增生，內(nèi)彈力板自然彎曲，內(nèi)皮細(xì)胞扁平；模型組肺細(xì)小動脈中膜平滑肌增生，外膜膠原纖維密集，內(nèi)彈力板扭曲，內(nèi)皮細(xì)胞突起；提示慢性肺動脈高壓模型建造成功。

光鏡下，色甘酸鈉組、姜黃素組相比模型組肺動脈管壁較薄，平滑肌細(xì)胞增生較少，內(nèi)彈力板自然彎曲，管腔未見明顯改變（圖1），同時兩組 WA／TA明顯低于模型組（P＜0.05）、EA／TA明顯高于模型組（P＜0.05），提示藥物干預(yù)有效；兩藥物干預(yù)組相比正常組 WA／TA、EA／TA差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示藥物干預(yù)效果尚不完全；兩藥物 WA／TA、EA／TA差異不明顯（P＞0.05），藥效相近（表1）；電鏡下，色甘酸鈉組、姜黃素組血管結(jié)構(gòu)基本正常，平滑肌增生及膠原增生較模型組輕。

Tab.1 Changes of WA／TA、EA／TA in four groups（%，，n＝24）

Tab.1 Changes of WA／TA、EA／TA in four groups（%，，n＝24）

Ⅰ：Normal group；Ⅱ：Hypoxia hypercapnia group；Ⅲ：Disodium cromoglycate group；Ⅳ：Curcumin group；WA／TA：Vessel wall area／total area；EA／TA：Vessel cavity area／total area*P＜0.05 vsⅠ group； ＃P＜0.05 vsⅡ group；TBS：Tryptase

Group WA／TA EA／TAⅠ37.98±2.31 62.02±2.31Ⅱ61.71±3.08* 38.29±3.08*Ⅲ51.51±2.48*＃ 48.49±2.48*＃Ⅳ48.56±2.77*＃ 51.44±2.77*＃

Fig.1 Morphological observation of pulmonary arteriole in rats（HE×200）

2.2 肥大細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

電鏡下，正常組肺小動脈周圍肥大細(xì)胞胞膜完整；模型組肥大細(xì)胞內(nèi)顆粒減少，胞膜不完整；色甘酸鈉組、姜黃素組肥大細(xì)胞胞膜較完整（圖2）。

Fig.2 Ultrastructural observation of pulmonary arteriole MC in rats（×10 000）

2.3 肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色

顯微鏡下觀察可見正常組肺細(xì)小動脈周圍肥大細(xì)胞內(nèi)粗大顆粒染成紫紅色，未脫顆粒細(xì)胞胞膜完整，胞漿染色加深，脫顆粒細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，胞漿淡染。模型組相比正常組肺細(xì)小動脈周圍NMC明顯增多（P＜0.05），DR增高（P＜0.05）；色甘酸鈉組、姜黃素組相比模型組 NMC較少（P＜0.05），DR降低；色甘酸鈉組的NMC、DR值相比姜黃素組未明顯降低（P＞0.05），正常組的 NMC、DR值與兩干預(yù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

Tab.2 NMC、DRof Toluidine blue staining in four groups（，n＝24）

Tab.2 NMC、DRof Toluidine blue staining in four groups（，n＝24）

Ⅰ：Normal group；Ⅱ：Hypoxia hypercapnia group；Ⅲ：Disodium cromoglycate group；Ⅳ：Curcumin group；NMC：Number of mast cell；DR：Degranulation rate*P＜0.05 vsⅠ group；＃P＜0.05 vsⅡ group

Group NMC（cells／HPF） DR（%）3.05±0.62 18.33±10.40Ⅱ7.31±1.82* 56.02±2.39*ⅢⅠ4.18±1.55*＃ 20.17±10.88*＃Ⅳ4.46±1.30*＃ 22.34±13.42*＃

2.4 肥大細(xì)胞類胰蛋白酶（TBS）免疫組化檢測

光鏡下可見，正常組的肺細(xì)小動脈周圍肥大細(xì)胞胞漿染成棕黃色，模型組相比正常組肺細(xì)小動脈周圍肥大細(xì)胞細(xì)胞數(shù)即TBS陽性細(xì)胞明顯增多（P＜0.05）；色甘酸鈉組、姜黃素組相比模型組陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）；色甘酸鈉組的陽性細(xì)胞數(shù)相比姜黃素組未明顯降低（P＞0.05），正常組的陽性細(xì)胞數(shù)與兩干預(yù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表 3，圖 3）。

Tab.3 Changes the number of mast cells with TBSin four groups（，n＝24）

Tab.3 Changes the number of mast cells with TBSin four groups（，n＝24）

Ⅰ：Normal group；Ⅱ：Hypoxia hypercapnia group；Ⅲ：Disodium cromoglycate group；Ⅳ：Curcumin group；TBS：Tryptase*P＜0.05 vsⅠ group；＃P＜0.05 vsⅡ group

Group TBS（cells／HPF）3.05±0.62Ⅱ7.31±1.82*Ⅲ4.18±1.55*＃ⅠⅣ4.46±1.30*＃

Fig.3 Immunohistochemical staining of TBSin mast cells in rats（IHC×200）

3 討論

MC中類胰蛋白酶可通過多種特性促進(jìn)血管重塑：具有促進(jìn)纖維化的生物學(xué)功能，通過肺成纖維細(xì)胞表面的蛋白酶活化受體（proteinase-activated receptor，PAR）-2的激活誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖，肺動脈平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增生，肺血管壁I型膠原的合成，最終導(dǎo)致肺血管壁的膠原纖維過量生成，膠原沉積［6，7］，從而導(dǎo)致肺動脈高壓。此外，MC中類糜蛋白酶在低氧下由MC釋放，可以促進(jìn)局部血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生，而不依賴血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，從而提高血管緊張度。同時可激活內(nèi)皮素和基質(zhì)金屬蛋白酶 13（MMPs-13）［8，9］，內(nèi)皮素可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠原增殖，并參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［10］。MMPs-13水平升高可促進(jìn)血管膠原裂解，導(dǎo)致低分子量膠原片段沉積，這些片段又會刺激血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增生，從而加劇血管壁重塑［11］。

近年研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以抑制慢性低O2高CO2性肺動脈平滑肌增生、減少肺血管壁膠原沉積、改善肺血管結(jié)構(gòu)重塑。在本實(shí)驗(yàn)研究中，模型組相比正常組 WA／TA比值增大（P＜0.05）、EA／TA比值減?。≒＜0.05），肺動脈平滑肌細(xì)胞增生，血管外膜膠原密集，肺血管明顯重塑，提示慢性肺動脈高壓模型建造成功。同時MC胞內(nèi)顆粒減少，胞膜不完整。而姜黃素干預(yù)組相比模型組MC胞膜穩(wěn)定，減少脫顆?，F(xiàn)象，WA／TA比值降低（P＜0.05）、EA／TA比值增大（P＜0.05），肺動脈平滑肌細(xì)胞不明顯增生，內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)彈力板等結(jié)構(gòu)基本正常，血管外膜膠原未見明顯沉積，肺血管重塑減輕。由此推測姜黃素可以通過穩(wěn)定MC膜，抑制MC脫顆粒，從而防止顆粒中細(xì)胞因子和酶類參與慢性低氧下肺動脈高壓肺血管重塑作用。

此外，Nishikawa等研究報道姜黃素可抑制血管周圍等結(jié)締組織型肥大細(xì)胞激活引起的慢性炎癥反應(yīng)，減輕結(jié)締組織增生［12］。Baek等用 PAR-2和PAR-4受體激動劑在有姜黃素和無姜黃素的條件下培養(yǎng)人肥大細(xì)胞，結(jié)果姜黃素存在的條件下TNF-α和類胰蛋白酶分泌減少，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過ERK通路抑制肥大細(xì)胞的激活，減少肥大細(xì)胞的脫顆粒［13］。這些發(fā)現(xiàn)證明姜黃素在機(jī)體內(nèi)存在的情況下肥大細(xì)胞的增殖和激活作用可受到一定抑制。大量證據(jù)表明姜黃素可能是改善慢性低氧性肺動脈高壓肺血管重塑頗具前景的藥物，值得進(jìn)一步研究。

然而姜黃素藥理作用復(fù)雜，肥大細(xì)胞的生物學(xué)特性和作用機(jī)制也有待進(jìn)一步的研究，動物模型與人之間也存在許多差異，有待進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。因此，姜黃素作為臨床藥物預(yù)防和治療慢性肺動脈高壓還需要更深入的探索研究。

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