齊敏友，楊鈞杰，周 斌，潘定一，孫 嫻

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州310014）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致糖尿病患者終末期腎病的首要原因。眾多研究表明，氧化應(yīng)激、血流動(dòng)力學(xué)改變、纖維化和炎癥因素以及激酶途徑在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用［1］。近年來(lái)氧化應(yīng)激和炎癥因素，尤其是炎癥因子腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素 －6（interleukin-6，IL-6）在DN發(fā)病中的作用越來(lái)越受到學(xué)者的重視［2］。熊果酸（ursolic acid，UA）是一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物，已被證明具有抗腫瘤、抗炎、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等作用［3，4］。Chen［5］等發(fā)現(xiàn) UA能夠通過(guò)抑制腎組織核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活性和 P-選擇素（P-selectin）的表達(dá)抗 DN，但UA是否可以通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α和IL-6而抗DN尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)四氧嘧啶建立糖尿病腎病小鼠模型，觀察UA對(duì)腎組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)和TNF-α、IL-6的作用，為進(jìn)一步研究UA抗DN作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑

熊果酸（HPLC測(cè)定純度98%），由湖南上禾生物科技提供；四氧嘧啶，由Sigma公司生產(chǎn)，上海貝基生物有限公司分裝，批號(hào)：20080210；TNF-α、IL-6試劑盒，由武漢博士德生物工程有限公司提供；尿素氮、肌酐、丙二醛、超氧化物歧化酶試劑盒、考馬斯亮蘭測(cè)試盒，均由南京建成生物工程有限公司提供。

1.2 主要儀器設(shè)備

穩(wěn)豪血糖儀和血糖試紙（美國(guó)強(qiáng)生公司）；HM325型輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（德國(guó)美康公司）；離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)（鞏義市英峪予華儀器廠）；104型電子天平（Made by Mettler-Toledo Group）；WB22型恒溫水浴箱（Made in German）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性昆明種小鼠，體重（20±2）g，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：SCXK（浙）-2008-0033。

1.4 糖尿病小鼠腎病模型的建立

雄性昆明種小鼠，分籠飼養(yǎng)。禁食不禁水12 h后，一次性尾靜脈注射四氧嘧啶（70 mg／kg）。72 h后，空腹尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖高于13.9 mmol／L者視為糖尿病小鼠模型，隨機(jī)分為模型組和熊果酸組，每組10只，另取10只正常小鼠作為對(duì)照組。熊果酸以生理鹽水混懸35 mg／kg灌胃，連續(xù)給藥 8周。對(duì)照組和模型組用等體積生理鹽水灌胃。

1.5 血糖、肌酐和尿素氮的測(cè)定

末次給藥后空腹12 h，用血糖測(cè)定儀測(cè)定各組小鼠血糖。摘眼球取血，靜置，4℃離心（3 500 r／min，10 min），取上清-20℃保存待測(cè)。血清肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（blood urine nitrogen，BUN）含量按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定。

1.6 臟器系數(shù)

處死小鼠，快速取出左側(cè)腎臟，剔除周?chē)Y(jié)締組織和脂肪，生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱(chēng)取腎臟重量，根據(jù)末次體重計(jì)算腎臟臟器系數(shù)（腎臟重／體重）。

1.7 腎組織 MDA含量、SOD活力及炎癥因子TNF-α、IL-6的測(cè)定

取適量腎組織，冰浴條件下制10%勻漿液，4℃離心（3 000 r／min，10 min），取上清，-20℃保存。腎組織SOD活性和MDA含量按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定；ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-6的水平。

1.8 組織學(xué)檢測(cè)

取右腎，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，經(jīng)HE染色后于光鏡下觀察其病理學(xué)改變。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對(duì)糖尿病小鼠一般體征、血糖和臟器系數(shù)的影響

對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好、反應(yīng)靈敏、毛色光亮，尿量正常，體重逐漸增加。模型組小鼠精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，并表現(xiàn)出明顯的多飲、多尿癥狀，同時(shí)體重減輕，血糖較對(duì)照組顯著上升（P＜0.01，表1）、腎臟臟器系數(shù)明顯增大（P＜0.05）。UA組小鼠一般體征較對(duì)照組相近，血糖較模型組有明顯下降（P＜0.05），臟器系數(shù)亦明顯減?。≒＜0.05），表明UA能夠有效降低DN小鼠血糖，改善腎臟肥大。

Tab.1 Effects of ursolic acid on blood glucose and the ratio of kidney weight to body weight（，n＝10）

UA：Ursolic acid*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs model

Group Glucose（mmol／L） Kidney weight／body weight（mg／g ）Control 5.4±0.8 5.5±0.6 Model 19.8±1.2** 7.1±0.8*UA 13.3±1.1＃ 6.2±0.9＃

2.2 熊果酸對(duì)小鼠Cr和BUN的影響

模型組小鼠Cr和BUN水平較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）；UA組 Cr和 BUN水平均明顯低于模型組（P＜0.05，表2），表明 UA對(duì) DN小鼠腎功能有明顯改善作用。

Tab.2 Effects of ursolic acid on renal function in renal tissue（，n＝10）

BUN：Blood urine nitrogen；Cr：Creatinine；UA：Ursolic acid*P＜0.05 vs control；＃P＜0.05 vs model

Group Cr（μmol／L） BUN（mmol／L）Control 75.5±9.6 6.5±1.1 Model 90.1±9.8* 13.1±2.1*UA 81.2±8.9＃ 8.2±1.6＃

2.3 熊果酸對(duì)糖尿病小鼠腎組織 SOD活力和MDA含量的影響

模型組小鼠腎組織中SOD活力明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），而 MDA含量顯著升高（P＜0.01），提示機(jī)體抗氧化能力下降，腎組織中存在過(guò)度的氧自由基；UA組 SOD活性明顯增加（P＜0.05），同時(shí)MDA含量顯著減少（P＜0.01，表3），提示 UA能夠提高腎組織的抗氧化能力，可能通過(guò)消除氧自由基從而保護(hù)腎組織。

Tab.3 Effects of ursolic acid on the activitity of SODand the level of MDA in renal tissue（，n＝10）

Tab.3 Effects of ursolic acid on the activitity of SODand the level of MDA in renal tissue（，n＝10）

SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malondialdehyde；UA：Ursolic acid*P＜0.05，**P＜0.01 vs control； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

Group SOD（U／mg pro） MDA（nmol／mg pro ）Control 109.8±13.1 4.3±0.3 Model 90.2±8.7* 7.1±0.4**UA 98.5±9.8＃ 5.1±0.2＃＃

2.4 熊果酸對(duì)腎組織中炎癥因子TNF-α和IL-6的影響

模型組兩種炎癥因子濃度較對(duì)照組均顯著升高（P＜0.01）；給予 UA干預(yù)后能明顯降低 TNF-α和IL-6水平（P＜0.05，表 4）。提示 UA可通過(guò)抑制DN腎組織炎癥因子的表達(dá)保護(hù)腎臟。

Tab.4 Effects of ursolic acid on the expression of TNF-αand IL-6 in renal tissue（，n＝10）

Tab.4 Effects of ursolic acid on the expression of TNF-αand IL-6 in renal tissue（，n＝10）

TNF-α：Tumor necrosis factor-α；IL-6：Interleukin-6；UA：ursolic acid**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs model

Group TNF-α（ng／ml） IL-6（pg／ml ）Control 1.21±0.23 124.8±10.1 Model 2.73±0.34** 164.2±12.8**UA 1.92±0.41＃ 139.5±11.7＃

2.5 熊果酸對(duì)腎組織結(jié)構(gòu)的影響

腎組織進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察。結(jié)果顯示：對(duì)照組腎小管排列整齊，未出現(xiàn)腎小管-間質(zhì)損傷，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞。模型組腎固有細(xì)胞萎縮，排列紊亂，腎小管-間質(zhì)有顯著損傷并可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。UA組明顯改善腎固有細(xì)胞狀態(tài)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少（圖 1）。

Fig.1 Pathological changes of mice renal tissue histopathology of testicular tissues in each group（HE ×200）

3 討論

本次研究以四氧嘧啶誘導(dǎo)小鼠糖尿病腎病模型，小鼠空腹血糖顯著升高，表明模型初步建立。腎功能及HE染色結(jié)果顯示：造模小鼠血清肌酐和尿素氮水平明顯上升，腎小球體積顯著增大，腎小管排列紊亂，腎小管-間質(zhì)有顯著損傷，進(jìn)一步表明DN模型建立成功。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組小鼠腎臟抗氧化能力減弱，炎癥因子（TNF-α、IL-6）生成增加。干預(yù)藥熊果酸是一種非水溶性有機(jī)化合物，用生理鹽水＋羧甲基纖維素鈉溶解效果不理想，因此選擇用生理鹽水制成混懸液，超聲混勻后灌胃。DN小鼠給予熊果酸干預(yù)后能夠有效降低血糖，提高腎組織抗氧化能力，抑制炎癥因子表達(dá)，改善腎功能，對(duì)腎臟起保護(hù)作用。

大量研究表明，高血糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）過(guò)度積聚是其重要表現(xiàn)之一，過(guò)多的ROS能夠引起脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物，如MDA、羥基和酮基等，進(jìn)而使蛋白質(zhì)和氨基酸氧化、交聯(lián)導(dǎo)致腎損傷［6］；此外，Mona［7］等研究發(fā)現(xiàn)ROS能夠介導(dǎo)腎組織中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎組織炎性損傷和纖維化。機(jī)體抗氧化能力降低是氧化應(yīng)激的另一個(gè)重要表現(xiàn)，SOD是其中一種主要的抗氧化酶，主要通過(guò)清除超氧陰離子保護(hù)細(xì)胞免受損傷，SOD活力高低可間接反映機(jī)體清除自由基、保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷的能力。我們的研究結(jié)果顯示，模型組小鼠腎組織中MDA含量較正常組增加65.1%，而 SOD活力降低17.9%，表明四氧嘧啶所致DN小鼠腎組織氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)。UA干預(yù)后，小鼠血糖較模型組明顯下降，腎組織中MDA含量下降28.2%，SOD活力上升9.2%，表明熊果酸具有較好的降血糖和抗氧化能力，這與我們的前期研究及文獻(xiàn)報(bào)道一致［8，5］。

近年來(lái)，有關(guān)DN炎性損傷假說(shuō)日益完善：糖尿病狀態(tài)下，高血糖、血流動(dòng)力學(xué)紊亂和氧化應(yīng)激水平上升均能介導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，如白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞等，這些炎性細(xì)胞可以產(chǎn)生包括白細(xì)胞介素（interleukin-1，IL-1）、TNF-α、干擾素-γ（interferon-γ，INF-γ）等多種致炎因子，進(jìn)而誘導(dǎo)正常腎臟細(xì)胞產(chǎn)生一系列的趨化因子；產(chǎn)生的趨化因子進(jìn)一步誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而形成一個(gè)炎性循環(huán)，最終導(dǎo)致腎組織炎性損傷。TNF-α在腎損傷過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，一方面它作為一個(gè)炎癥信號(hào)放大器，介導(dǎo)IL-6等多種炎癥因子和趨化因子超表達(dá)，加劇炎癥反應(yīng)；另一反面又能誘導(dǎo)纖維化因子表達(dá)增加，引起腎固有細(xì)胞肥大和纖維化［9］。IL-6是另一個(gè)在DN發(fā)展過(guò)程中起重要作用的炎性因子，其超表達(dá)可引起內(nèi)皮通透性改變，誘導(dǎo)纖連蛋白表達(dá)增加，并與腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）增厚密切相關(guān)［10］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠腎組織炎性基本結(jié)構(gòu)損傷，細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，腎組織中TNF-α、IL-6含量較對(duì)照組明顯增多，腎功能下降。UA干預(yù)能夠有效減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減少TNF-α、IL-6生成，保護(hù)腎臟功能。提示UA可通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α、IL-6生成這一途徑，減輕DN的炎性損傷。

綜上所述，高水平的氧化應(yīng)激和炎癥因子TNF-α、IL-6的增多加劇DN過(guò)程，UA能有效減輕DN引起的腎臟損傷，其可能機(jī)制包括降血糖、增加機(jī)體抗氧化能力和抑制炎性因子TNF-α、IL-6的生成。由于目前對(duì)DN缺乏有效的治療手段，因此研究UA保護(hù)DN小鼠腎臟的作用和機(jī)制，對(duì)開(kāi)發(fā)中藥治療DN具有重要意義。

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