陳涵斌，應(yīng)麗麗，趙靈靈，項(xiàng)一軒，林刻智，王 衛(wèi)

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，2.溫州醫(yī)科大學(xué)病理教研室，3.溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院，浙江溫州325015）

康艾注射液是一種運(yùn)用于臨床的抗癌輔助用藥，選用黃芪、人參和苦參素，經(jīng)過先進(jìn)的生產(chǎn)工藝制備而成的中藥注射液。黃芪屬補(bǔ)氣中藥，含有多種氨基酸、微量元素等多種有效成分。人參為歷代常用的益氣扶正藥，其化學(xué)成分和藥理實(shí)驗(yàn)表明，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移的作用，并能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的吞噬、殺傷活性，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)骨髓代謝，增加白細(xì)胞生成，與放療、化療藥物并用可防止白細(xì)胞下降。苦參素有清熱解毒、抗菌消炎、調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤等作用。目前國內(nèi)關(guān)于康艾注射液的研究，主要集中在緩解化療藥物的毒副作用和增強(qiáng)腫瘤患者免疫功能方面。然而康艾注射液增強(qiáng)患者的抗腫瘤免疫機(jī)制尚未明確，未見康艾注射液對巨噬細(xì)胞作用的文獻(xiàn)報(bào)道。本文以大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophages，AM）及 腹 腔 巨 噬 細(xì) 胞 （peritoneal macrophages，PM）內(nèi)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）為指標(biāo)，研究康艾注射液對大鼠巨噬細(xì)胞酶活性影響，并觀察胸腺、脾臟形態(tài)改變，為開發(fā)中藥類新的機(jī)體免疫增強(qiáng)劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理

健康雄性SD大鼠24只（溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），體重180～200 g，隨機(jī)均分成2組（n＝12）：對照組和實(shí)驗(yàn)組，分2籠飼養(yǎng)。給大鼠稱重，實(shí)驗(yàn)組按5 ml／kg·d腹腔注射康艾注射液（長白山制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字 Z20016868），對照組注射等容積生理鹽水。兩組大鼠均用復(fù)合飼料飼養(yǎng)30 d。觀察實(shí)驗(yàn)動物一般情況，每天在規(guī)定時(shí)間內(nèi)稱量大鼠體重并觀察飲食、皮毛、活動狀況和反應(yīng)等。

1.2 AM及PM的灌洗與培養(yǎng)及破碎

分別取上述實(shí)驗(yàn)組及對照組大鼠，股動脈放血處死大鼠，無菌室內(nèi)，常規(guī)消毒。原位灌洗大鼠AM和PM，每只大鼠每次從氣管內(nèi)注入4℃生理鹽水10 ml，輕輕按揉肺部3 min，抽回灌洗液重復(fù)3次。腹腔注入4℃生理鹽水20 ml，輕輕按揉腹部3 min，抽回腹腔液重復(fù)3次。同組動物所得的AM及PM灌洗液分別離心，2 000 r／min，15 min，棄上清液后用Hank’s液再次離心洗滌，棄上清液后沉淀之細(xì)胞團(tuán)用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液分別調(diào)節(jié)AM、PM濃度至2×106cells／ml，以每瓶1 ml分裝至培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)［1，2］。取上述經(jīng)37℃貼壁培養(yǎng)2 h的AM與PM，棄上清液及非貼壁細(xì)胞用37℃生理鹽水輕輕洗滌1次后每瓶內(nèi)加入1 m l三蒸水，置低溫冰箱內(nèi)-80℃、80℃反復(fù)凍融5次，每次30 min，制成破碎的巨噬細(xì)胞懸液。

1.3 AM與PM內(nèi)微蛋白含量、LDH、GSH-Px和 i-NOS酶活性的生化檢測

BCA法測超微蛋白含量，生化試劑盒檢測法測定其LDH、GSH-Px和iNOS酶活力，操作均嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒使用說明和文獻(xiàn)［3］進(jìn)行（超微蛋白含量、LDH、GSH-Px和 iNOS酶活性生化檢測試劑盒均購自南京成生物工程研究所）。酶活力單位采用國際單位（U），LDH活力單位定義為：每毫克蛋白37℃與基質(zhì)作用15 min，反應(yīng)體系中產(chǎn)生1μmol丙酮酸為1 U。GSH-Px活力單位定義為：每毫克蛋白37℃，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度減低1μmol／l為1 U。iNOS活力單位定義為：每毫克蛋白每分鐘生成1 nmol NO為1 U。

1.4 AM與 PM內(nèi) ACP、SOD和 SDH酶活性的ELISA法檢測

利用ELISA競爭法測定AM與PM內(nèi)ACP、SOD和SDH酶活性，操作步驟均嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒使用說明進(jìn)行（ACP、SOD和SDH的ELISA檢測試劑盒均購自上海藍(lán)基生物公司）。

1.5 大鼠胸腺和脾臟組織形態(tài)學(xué)的制備

股動脈放血處死大鼠，迅速分離胸腺和脾臟，將每只大鼠胸腺和脾臟縱切，取3 mm厚小塊組織放入10%中性福爾馬林固定液中固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成厚度為4 μm切片，蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封固，光鏡觀察胸腺和脾臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

對照組大鼠皮毛光滑，身體較壯，反應(yīng)靈敏，飲食、活動、體重增長正常；實(shí)驗(yàn)組動物皮毛有光澤，身體健壯，反應(yīng)非常靈敏，飲食、活動、精神狀態(tài)明顯比對照組好，體重有所增加?？蛋⑸湟汉蜕睇}水注射期間，各組大鼠體重呈持續(xù)上升的趨勢，但兩組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

Tab.1 Comparison of rat body weight between the two groups after one month（g，，n＝12）

Tab.1 Comparison of rat body weight between the two groups after one month（g，，n＝12）

NC：Normal control；EG：Experimental group

50±0.52 Group One day Ten days Twenty days Thirty days NC 198.67±5.43 245.08±0.79 285.17±0.83 327.00±0.73 EG 199.25±2.17 246.00±1.54 285.67±1.07 327.

2.2 光鏡下各組大鼠胸腺和脾臟組織病理形態(tài)學(xué)變化

正常組脾臟由紅髓和白髓組成，紅髓由脾索和脾竇所構(gòu)成，白髓包括動脈周圍淋巴鞘、淋巴小結(jié)和邊緣區(qū)構(gòu)成，動脈周圍淋巴鞘由少數(shù)幾層淋巴細(xì)胞構(gòu)成（圖1A），淋巴小結(jié)致密、深染，未見生發(fā)中心（圖1B）。和正常組相比，實(shí)驗(yàn)組動脈周圍淋巴鞘增厚，淋巴細(xì)胞層次增加（圖1C），淋巴小結(jié)體積增大，中央可見生發(fā)中心擴(kuò)大（圖1D，圖1見彩圖頁Ⅰ）。

正常組胸腺由多個(gè)胸腺小葉構(gòu)成，每個(gè)胸腺小葉由皮質(zhì)和髓質(zhì)組成，皮質(zhì)由致密淋巴細(xì)胞構(gòu)成（圖2A），髓質(zhì)由疏松結(jié)締組織、散在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞構(gòu)成（圖2B），并可見散在胸腺小體。實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，胸腺形態(tài)上未見明顯差異（圖2C、2D，圖2見彩圖頁Ⅰ）。

2.3 AM與PM中微蛋白含量、LDH、GSH-PX和i-NOS酶活性

實(shí)驗(yàn)組大鼠AM與PM內(nèi)微蛋白含量、LDH、iNOS和GSH-Px酶活性明顯高于對照組，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，表 2、表 3）。

Tab.2 Comparison of rat AM micro protein content，LDH，GSHPx and iNOSenzyme activity between the two groups（，n＝12）

Tab.2 Comparison of rat AM micro protein content，LDH，GSHPx and iNOSenzyme activity between the two groups（，n＝12）

NC：Normal control；EG：Experimental group；AM：Alveolar macrophages；GSH-Px：Glutathione peroxidase；iNOS：Inducible nitric oxide synthase；LDH：Lactate dehydrogenase*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup

Group Proteinconcentration（μg／ml）GSH-Px（U）iNOS（U／ml）LDH（U／ml ）NC 109.46±6.28 42.08±2.10 0.42±0.015 22.29±0.98 EG 175.25±11.25*65.44±73.36**0.68±0.12* 37.42±1.28**

Tab.3 Comparison of rat PM micro protein content，LDH，GSHPx and iNOSenzyme activity between the two groups（，n＝12）

Tab.3 Comparison of rat PM micro protein content，LDH，GSHPx and iNOSenzyme activity between the two groups（，n＝12）

NC：Normal control；EG：Experimental group；PM：Peritoneal macrophages；GSH-Px：Glutathione peroxidase；iNOS：Inducible nitric oxide synthase；LDH：Lactate dehydrogenase*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup

Group Proteinconcentration（μg／ml）GSH-Px（U）iNOS（U／ml）LDH（U／ml ）NC 80.50±12.91 34.47±1.99 0.25±0.13 10.189±1.05 EG 138.47±8.49**51.11±2.91*0.48±0.041**19.26±5.62**

2.4 AM與PM中 ACP、SOD和SDH酶活性

實(shí)驗(yàn)組大鼠AM與PM內(nèi)SDH、SOD和ACP酶活性明顯高于對照組，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，表 4、表 5）。

Tab.4 Comparison of rat AMACP，SODand SDH enzyme activity between the two groups（，n＝12）

Tab.4 Comparison of rat AMACP，SODand SDH enzyme activity between the two groups（，n＝12）

NC：Normal control；EG：Experimental group；AM：Alveolar macrophages；SDH：Succinate dehydrogenase；SOD：Superoxide dismutase；ACP：Acid phosphatase*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup

Group SDH（ng／ml）SOD（μg／ml）ACP（ng／ml ）NC 227.99±6.35 1.02±0.05 13.64±1.03 EG 270.09±15.51**1.22±1.23* 28.32±6.82**

Tab.5 Comparison of rat PM ACP，SOD and SDH enzyme activity between the two groups（，n＝12）

Tab.5 Comparison of rat PM ACP，SOD and SDH enzyme activity between the two groups（，n＝12）

NC：Normal control；EG：Experimental group；PM：Peritoneal macrophages；SDH：Succinate dehydrogenase；SOD：Superoxide dismutase；ACP：Acid phosphatase*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup

Group SDH（ng／ml）SOD（μg／ml）ACP（ng／ml ）NC 210.54±29.14 0.054±0.10 9.61±1.43 EG 248.73±8.80**0.084±0.07*17.68±0.97**

3 討論

近年來中醫(yī)中藥及其提取物在保護(hù)機(jī)體臟器功能、提高機(jī)體免疫力方面的作用越來越受重視［4］。臨床實(shí)踐表明康艾注射液能抑制殺滅腫瘤細(xì)胞、減輕放化療導(dǎo)致的骨髓抑制等不良反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［5］。

胸腺和脾臟分別為中樞淋巴器官和最大的周圍淋巴器官。和正常組相比，實(shí)驗(yàn)組脾臟鏡下見動脈周圍淋巴鞘增厚，淋巴細(xì)胞層次增加，淋巴小結(jié)體積增大，中央可見生發(fā)中心擴(kuò)大。動脈周圍淋巴鞘為脾臟的T細(xì)胞區(qū)，淋巴小結(jié)為脾臟的B細(xì)胞區(qū)，上述形態(tài)學(xué)的改變，表明脾臟T細(xì)胞和B細(xì)胞均激活，在一定程度上分別增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能。而胸腺為中樞淋巴器官，在T細(xì)胞發(fā)育成熟后其形態(tài)學(xué)改變不明顯，在人類，青春期后，胸腺逐漸萎縮，故本實(shí)驗(yàn)兩組胸腺形態(tài)上差異不明顯。巨噬細(xì)胞是一種重要的抗原呈遞細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞，在免疫啟動、調(diào)節(jié)和效應(yīng)階段都起到重要作用，并能夠合成和分泌50多種具生物學(xué)活性的炎性產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的吞噬作用和分泌功能［6］。但是未活化的巨噬細(xì)胞的吞噬殺傷作用有限，受到刺激的巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟為活化巨噬細(xì)胞，使細(xì)胞體積增大、活力增強(qiáng)、吞噬功能增強(qiáng)，多種酶活性顯著增強(qiáng)。因此活化是巨噬細(xì)胞有效參與免疫監(jiān)控的條件，是其實(shí)現(xiàn)多種功能的基礎(chǔ)。

ACP是體內(nèi)一種非特異性的溶酶體酶，參與肺部的防御反應(yīng)，是巨噬細(xì)胞內(nèi)最有代表性的水解酶之一。正常條件下，LDH存在于膜性結(jié)構(gòu)完整的肺泡巨噬細(xì)胞的胞漿中，肺泡腔中含量非常少。當(dāng)細(xì)胞受損傷或膜通透性增加時(shí)，LDH會大量逸至胞外，使細(xì)胞液外LDH活力增強(qiáng)。其功能是催化乳酸脫氫成為丙酮酸或丙酮酸還原為乳酸，即參與了能量物質(zhì)的有氧氧化與無氧酵解，尤其是巨噬細(xì)胞在吞噬過程中其能量來源主要通過糖酵解途徑，糖酵解過程中產(chǎn)生的乳酸使細(xì)胞內(nèi)pH下降有利于溶酶體酶發(fā)揮作用，故LDH活性被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞被激活的標(biāo)志之一。所以，有研究表明：巨噬細(xì)胞內(nèi)LDH、ACP活性的升高被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞被激活的標(biāo)志。本研究顯示，相比對照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠AM與PM內(nèi)LDH、ACP活性均具有上調(diào)作用，提示康艾注射液對巨噬細(xì)胞有激活作用，揭示了康艾注射液通過激活巨噬細(xì)胞以增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。

SOD和GSH-Px是組織的兩種重要的抗氧化防御物質(zhì)。SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶類，可清除自由基，減輕氧化損傷，被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線［7-9］，SOD的高低可以間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化脂質(zhì)還原的酶［10］，特異地催化GSH對過氧化氫的還原反應(yīng)，還可清除活性氧及氧化硝酸鹽等成分，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。張學(xué)會等［11］研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙、黃芪多糖等多種成分有促進(jìn)腦組織中SOD和GSH-Px抗氧化酶活性的作用，加速腦組織中自由基的清除。本研究顯示，相比對照組，實(shí)驗(yàn)組AM與PM內(nèi)抗氧化酶GSH-Px活性和SOD活性升高，提示實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞抗脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，即康艾注射液提高了機(jī)體的抗氧化水平，減少了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物對巨噬細(xì)胞胞膜的損傷，從而在一定程度上起到了保護(hù)細(xì)胞膜和提高機(jī)體免疫力的作用。證實(shí)了康艾注射液具有清除自由基、抗氧化損傷、保護(hù)生物膜等多種生物學(xué)活性。

NOS可分為結(jié)構(gòu)型（cNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）。i-NOS是體內(nèi)合成NO的主要限速酶，主要存在于巨噬細(xì)胞，它的活性變化直接影響NO的生成量和生物效應(yīng)，其活性不受Ca2＋濃度的影響［10］。本研究顯示，相比對照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠AM與PM內(nèi)iNOS活性升高，說明康艾注射液可改善巨噬細(xì)胞功能，在防治感染和提高機(jī)體免疫力中具有重要意義。

SDH是線粒體有氧呼吸反應(yīng)的關(guān)鍵酶，參與三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞的生存和活動提供能量，一般其活性高低可作為評價(jià)三羧酸循環(huán)運(yùn)行程度的指標(biāo)。一些病理情況下，線粒體損傷的加劇，最終會導(dǎo)致SDH活性下降［12］。SDH活性升高時(shí)，細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝功能增強(qiáng)，提高細(xì)胞正常生理功能活動。本研究顯示，相比對照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠AM與PM內(nèi)SDH活性均升高，說明康艾注射液可為細(xì)胞的生存和活動提供能量，提高細(xì)胞正常生理功能活動。

康艾注射液可能是通過對巨噬細(xì)胞的激活，并由激活的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)提高患者的免疫功能，而達(dá)到抗腫瘤的作用機(jī)制，這為康艾注射液作為用于癌癥輔助用藥奠定了理論基礎(chǔ)。

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