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        吳茱萸次堿對肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室重構(gòu)的影響*

        2014-01-22 03:24:00李先偉汪向明楊解人
        關(guān)鍵詞:吳茱萸右心室膠原

        李先偉,汪向明,李 曙,楊解人△

        (1.皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院病理科,3.皖南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,安徽蕪湖241002)

        肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是以肺動(dòng)脈壓力增高為特征的一類疾病,主要病理變化為肺動(dòng)脈血管管腔狹窄、閉塞,引起肺動(dòng)脈壓力升高、阻力增加,近而加重右心室后負(fù)荷,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致右室肥厚、心力衰竭甚至死亡,故防治肺動(dòng)脈高壓和右心室重構(gòu)具有重要的意義[1,2]。研究表明氧化應(yīng)激在肺動(dòng)脈高壓右心重構(gòu)中發(fā)揮了重要的作用[3]。NADPH氧化酶 4(NADPH oxidase 4,NOX4)誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基(reactive oxygen specie,ROS)可促進(jìn)肺動(dòng)脈血管外膜成纖維細(xì)胞增殖并抑制其凋亡,在PH右心室重構(gòu)發(fā)生過程中起著重要作用[4]。

        吳茱萸次堿(rutaecarpine,Rut)是從吳茱萸中提取的一種吲哚喹唑啉類生物堿,具有舒張血管降低血壓、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、保護(hù)心肌缺血再灌注損傷、減輕減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)等作用[5-7]。最新的研究表明,Rut能夠減輕缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損失及凋亡,其機(jī)制與其抗氧化,抑制NADPH氧化酶的表達(dá)有關(guān)[8]?;谝陨系难芯勘尘?,本研究以肺動(dòng)脈高壓右心室重構(gòu)為模型,選擇NOX4為靶點(diǎn),探討Rut對肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室重構(gòu)的保護(hù)作用及機(jī)制,為防治心肌重構(gòu)提供了新思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        野百合堿(Monocrotaline,MCT)(美國 Sigma)。吳茱萸次堿(≥98%,分子式:C18H13N3O,上海純優(yōu)生物科技有限公司)。Masson染色試劑盒(南京凱基)??偪寡趸芰Γ╰otal antioxidative capacity,TAOC)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及BCA蛋白檢測試劑盒均購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。TRI-zol RNA提取試劑盒購自美國 Invitrogen公司。PrimeScriptTM RT reagent Kit、Power SYBR Green PCR Master Mix(大連寶生物工程有限公司),引物設(shè)計(jì)合成(上海生工)。小鼠抗大鼠GAPDH、NOX4單克隆抗體(美國Santa Cruz),小鼠抗大鼠collagen I及 collagen III單克隆抗體(美國 Abcam),LunimataTM Crescendo發(fā)光液(美國 Millipore)。

        1.2 方法

        1.2.1 動(dòng)物分組及模型的制備 雄性SD大鼠48只,體重180~220 g(南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物試驗(yàn)中心),許可證號:SCXK(軍)2007-012。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,按體重隨機(jī)分為:正常對照組(Control);野百合堿(MCT)組;MCT+ Rut(20 mg/kg)劑量組;MCT+ Rut(40 mg/kg)劑量組(n=12)。MCT(60 mg/kg)單次皮下注射復(fù)制肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型。Rut用羧甲基纖維素鈉充分混勻,于次日上午8∶00-10∶00開始灌胃給藥,每天一次連續(xù)給藥4周。所有大鼠實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食、飲水。

        1.2.2 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測定 給藥4周后,大鼠用戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉。將連有壓力換能器的聚乙烯導(dǎo)管(直徑0.5 mm)經(jīng)右頸外靜脈插入右心室及肺動(dòng)脈,用MedLab多導(dǎo)生理記錄儀分別記錄右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure,RVSP)和平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)。

        1.2.3 組織標(biāo)本采集與處理 血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)檢測完畢后,頸動(dòng)脈采血后處死大鼠,立即打開胸腔迅速分離心臟,置于預(yù)冷的PBS中洗滌干凈,另取下大鼠右后肢脛骨。準(zhǔn)確分離右心室、左心室加室間隔,準(zhǔn)確稱重,計(jì)算右心室(right ventricle,RV)/(左心室 +室間隔)(left ventricle(LV)+septum(S))質(zhì)量比;用游標(biāo)卡尺測量脛骨長度,計(jì)算RV/脛骨長度比值。取右心室心尖部固定于4%多聚甲醛以備石蠟切片;準(zhǔn)確稱取100 mg右心室置于液氮中研磨后加入 Trizol(1 m1),-80℃冰箱保存,用于相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)水平檢測;剩余右心室置于液氮中研磨后加入組織裂解液冰上裂解 30 min,12 000 r/min,4℃離心10 min,提取蛋白,用于相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)水平的檢測。

        1.2.4 右心室組織病理學(xué)及膠原沉積的觀察 取大鼠右心室心尖部以4%多聚甲醛固定48 h,石蠟包埋切片,行HE及Masson染色,分別觀察右心室病理變化及膠原沉積情況。Masson膠原染色按試劑盒說明書進(jìn)行。

        1.2.5 生化指標(biāo)測定 用DTX880多功能酶標(biāo)儀分別檢測右心室T-AOC及MDA含量。BCA法測定組織蛋白濃度。

        1.2.6 免疫組化檢測右心室NOX4蛋白表達(dá) 右心室石蠟切片,厚度約4μm,常規(guī)脫蠟至水,抗原修復(fù)液修復(fù)20 min,封閉液室溫封閉1 h,抗NADPH氧化酶(NADPH oxidase 4,NOX4)一抗(1∶200)4℃過夜,二抗(1∶200)室溫孵育 2 h,SABC室溫孵育 1 h,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片觀察。結(jié)果判斷:NOX4主要定位于細(xì)胞漿。陽性細(xì)胞表達(dá)呈黃至棕黃色顆粒。

        1.2.7 Real time PCR檢測右心室 NOX4、collagenⅠ和collfagenⅢ mRNA的表達(dá) 用Trizol等試劑提取組織總RNA后,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行RT反應(yīng)。所得cDNA在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7300 Real Time PCR System,Applied Biosystem)上進(jìn)行反應(yīng)。按照說明,使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒,以2μl cDNA為模板,以 GAPDH為內(nèi)參照,PCR擴(kuò)增基因片段。引物如表1。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置參照我們前期的研究方法[14]。數(shù)據(jù)分析用7300 System SDSSoftware軟件,統(tǒng)計(jì)ΔΔCt值,計(jì)算RQ值以比較各組mRNA的表達(dá)。

        Tab.1 Primer sequences used for amplification AR,collagenⅠand collagenⅢcDNA

        1.2.8 Western blot檢測右心室 NOX4、collagenⅠ和collagenⅢ蛋白表達(dá) 低溫提取右心室蛋白,BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣 50μg蛋白,12%SDSPAGE分離樣品,轉(zhuǎn)膜,封閉,分別滴加 GAPDH(1∶2 000)、NOX4(1∶500)、CollagenⅠ(1∶1 000)和 CollagenⅢ(1∶1 000)一抗 4℃過夜。洗膜,相應(yīng)二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。洗膜后將高靈敏的LunimataTM Crescendo發(fā)光劑加到膜的正面,暗室曝光、壓片、顯影。膠片掃描后用Image J 1.43(National Institutes of Health)軟件進(jìn)行灰度值分析并比較各組蛋白表達(dá)差異。

        1.3 統(tǒng)計(jì)分析

        2 結(jié)果

        2.1 吳茱萸次堿對肺動(dòng)脈高壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響

        與control相比,MCT處理組大鼠 RVSP、mPAP均顯著升高(P<0.01)。給予不同劑量吳茱萸次堿4周后,肺動(dòng)脈高壓大鼠RVSP、mPAP均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。提示吳茱萸次堿具有改善肺動(dòng)脈高壓血流動(dòng)力學(xué)的作用(表2)。

        Tab.2 Effect of rutaecarpine on RVSP and mPAP in monocrotaline-induced pulmonary hypertension of rats

        2.2 吳茱萸次堿對肺動(dòng)脈高壓大鼠RV/LV+S及RV/脛骨長度比值的影響

        因RV/LV+S及RV/脛骨長度比值不受體重及左心室重影響,是評價(jià)右心室肥厚程度的主要指標(biāo)。與control相比,MCT處理組 RV/LV+S及 RV/脛骨長度的比值均顯著升高(P<0.01),提示野百合堿皮下注射誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室明顯增生肥大。給予不同劑量吳茱萸次堿4周后,上述比值均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。表明吳茱萸次堿具有抑制肺動(dòng)脈高壓右心室重構(gòu)的作用(表3)。

        Tab.3 Effect of rutaecarpine on RV/LV+S and RV/Tibial length in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

        2.3 吳茱萸次堿對肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室組織形態(tài)學(xué)的影響

        與control相比,MCT處理組右心室心肌細(xì)胞增生肥大且排列紊亂、稀疏和胞漿腫脹,心肌細(xì)胞間隙增寬,部分區(qū)域心肌纖維化增生。而給予不同劑量吳茱萸次堿4周后上述病理變化均有不同程度的改善(圖 1)。

        Fig.1 Effect of rutaecarpine on morphological changes of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension of rats(HE×400)

        2.4 吳茱萸次堿對肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室膠原表達(dá)的影響

        Masson染色顯示膠原纖維為藍(lán)色,正常對照組右心室心肌細(xì)胞間隙清晰可見,血管旁膠原分布稀疏,著色較淡。與正常對照組相比,模型組大鼠右心室心肌細(xì)胞間質(zhì)和血管旁有較多明顯藍(lán)色深染;與模型組相比,吳茱萸次堿各劑量組右心室心肌細(xì)胞間質(zhì)和血管旁的藍(lán)色深染逐漸減少,膠原沉積現(xiàn)象逐漸減輕,說明吳茱萸次堿對肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室心肌膠原沉積有一定的改善作用(圖2)。經(jīng)realtime PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn),模型組大鼠右心室collagenⅠ和collagenⅢ mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),而給予不同劑量吳茱萸次堿4周后CollagenⅠ和CollagenⅢ的表達(dá)明顯降低(P<0.05,P<0.01,表 3,圖 3、圖 4)。

        Tab.3 Effect of rutaecarpine on the collagen Iand collagen IIImRNA and protein expression of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

        Fig.2 Effect of rutaecarpine on collagen accumulation of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension of rats(Masson’s trichrome stain×400)

        Fig.3 Effect of rutaecarpine on the collagen I and collagen III proteins expression of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

        Fig.4 Dissociation curve of collagenⅠ and collagenⅢ PCR product with real-time PCR

        2.5 吳茱萸次堿對肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室NOX4表達(dá)的影響

        經(jīng)real Time PCR、Western blot及免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),模型組右心室NOX4 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比,給藥不同劑量吳茱萸次堿4周后均能不同程度下調(diào)大鼠右心室NOX4 mRNA及蛋白的表達(dá)(表 4,圖 5、圖 6)。GAPDH和NOX4基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線分別在83℃和87℃左右處形成單一的熒光峰。說明 real-time PCR產(chǎn)物均具有特異性,無二聚體產(chǎn)生(圖7)。

        Fig.5 Expression of NOX4 protein in right ventricle was determined by immunohistochemisty staining(arrows indicated NOX4 positive staining)

        Fig.6 Effect of rutaecarpine on the NOX4 protein expression of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

        Fig.7 Dissociation curve of GAPDH and NOX4 PCRproduct with real-time PCR

        Tab.4 Effect of rutaecarpine on the NOX4 mRNA and protein expression of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

        2.6 吳茱萸次堿對肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室T-AOC和MDA的影響

        與control相比,模型組右心室 T-AOC明顯降低、MDA含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,與模型組相比,給藥不同劑量吳茱萸次堿4周后右心室T-AOC明顯增高、MDA含量顯著下降。提示吳茱萸次堿具有一定的抗氧化作用(P<0.05,P<0.01,表 5)。

        Tab.5 Effect of rutaecarpine on the T-AOC and MDA of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

        3 討論

        心室重構(gòu)是指心肌細(xì)胞受到外界和內(nèi)在刺激時(shí)為維持正常心功能作出的適應(yīng)性反應(yīng)[9]。PH時(shí)由于肺循環(huán)的壓力和阻力增加,可出現(xiàn)右心室負(fù)荷增大、右心功能不全,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致右心室重構(gòu),主要表現(xiàn)為右心室肥大、心肌充血水腫、心肌灶性肌漿凝結(jié),心肌間質(zhì)纖維化并伴有少量中性粒細(xì)胞浸潤等[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MCT誘導(dǎo)的 PH大鼠RVSP、mPAP、RV/(LV+S)、RV/脛骨長度和右心室膠原沉積及collagen I、collagen III的表達(dá)均顯著增高;右心室HE染色結(jié)果顯示,右心室心肌細(xì)胞出現(xiàn)排列紊亂,心肌細(xì)胞肥大、稀疏和胞漿腫脹,部分區(qū)域心肌纖維化增生。以上結(jié)果表明,野百合堿誘導(dǎo)的PH大鼠右心室明顯重構(gòu),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。

        傳統(tǒng)中藥吳茱萸屬蕓香科植物,在臨床應(yīng)用己有數(shù)千年歷史,具有廣泛的藥理學(xué)效應(yīng),如舒張血管、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗炎、抗腫瘤等。吳茱萸次堿(Rut)是從中藥吳茱萸中提取的一種吲哚喹唑啉類生物堿。整體、離體及細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)證據(jù)均表明,Rut具有顯著的心血管保護(hù)效應(yīng),如舒血管、降壓、保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷及減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)等作用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,Rut連續(xù)給藥4周后,PH大鼠的RVSP、mPAP、RV/(LV+S)、RV/脛骨長度和右心室膠原沉積及collagen I、collagen III的表達(dá)均顯著降低,右心室病理損傷明顯減輕。提示Rut對PH大鼠具有降低肺動(dòng)脈壓力、減輕右心室肥厚和纖維化的作用。

        肺動(dòng)脈高壓右心室重構(gòu)的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,氧化應(yīng)激在肺動(dòng)脈高壓右心重構(gòu)中發(fā)揮了重要的作用[3]。在PH右心重構(gòu)的動(dòng)物模型中,可觀察到右心組織氧化應(yīng)激水平顯著增高[10],而抑制過度的氧化應(yīng)激損傷能夠改善肺動(dòng)脈高壓及右心重構(gòu)[11,12]。大量研究表明NOX誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在肺血管重構(gòu)以及右心重構(gòu)中起著重要作用[13-15]。最新研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇及其衍生物通過抑制NOX2及NOX4的表達(dá)而抑制低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓右心室重構(gòu)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)野百合堿誘導(dǎo)的PH大鼠右心室NOX4的表達(dá)顯著增高,MDA含量明顯升高而T-AOC顯著降低。而給予Rut 4周后,PH大鼠右心室NOX4表達(dá)顯著降低,MDA含量明顯減少,T-AOC含量顯著升高。表明提示吳茱萸次堿可能通過抗氧化,下調(diào)NOX4的表達(dá)對PH大鼠右心室重構(gòu)具有一定的保護(hù)作用。但也有文獻(xiàn)報(bào)道,心肌NOX2的表達(dá)升高也參與了肺動(dòng)脈高壓右心室重構(gòu)的發(fā)生與發(fā)展[4],而吳茱萸次堿是否通過下調(diào)NOX2的表達(dá)而產(chǎn)生心臟保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究。

        綜上所述,吳茱萸次堿能夠緩解野百合堿誘導(dǎo)的PH大鼠右心室重構(gòu),其機(jī)制可能與其抑制NOX4的表達(dá),進(jìn)而降低氧化應(yīng)激損傷有關(guān),從而為擴(kuò)大吳茱萸次堿的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)支持和理論依據(jù)。

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