王先麗，陳龍菊

（湖北民族學院醫(yī)學院，恩施445000）

富硒板黨（Rich Selenium-Banqiao-Codonopsis Pilosula，BCPA）因出產(chǎn)于素有“中國硒都”之稱的湖北恩施板橋境內(nèi)而得名。1981年在全國藥材品種質(zhì)量鑒定會上定名為“中國板黨”，簡稱“板黨”。研究表明BCPA富含多糖、皂苷，具有抗缺氧、抗炎、抗疲勞及抗衰老等作用［1-5］。BCPA在促進健康，抗衰老及增加免疫力而倍受重視，然其內(nèi)在機制并不明確。本研究以不同年齡段的大鼠為對象，觀察BCPA注射液對老齡大鼠免疫功能的影響，探討其免疫調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2月齡、12月齡和 22月齡 SPF級 Wistar大鼠（雌雄各半），由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。分別作為年輕組、中年組、老齡組。每個年齡段大鼠隨機分為對照組和BCPA實驗組（n＝10）。

1.2 實驗藥品與儀器

小鼠抗大鼠IgGl、IgG2α及山羊抗兔IgG（晶美公司），刀豆蛋白 A（concanavalin A，ConA），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)CS）及鑰孔蟲戚血藍蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）（Sigma公司），PE（藻紅蛋白）標記抗大鼠CD3、CD8抗體及FITC（異硫氰酸熒光素）標記抗大鼠 CD4、CD44抗體（Biolegend公司），TMB（四甲基聯(lián)苯胺）過氧化物酶底物及HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）（大連寶生物），DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）細胞培養(yǎng)液（美國Gibco公司），注射佐劑明礬（Thermo Scientific公司），其它化學試劑為國產(chǎn)分析純試劑（湖北恩施樂之塬科技公司）。精密電子天平（上海天平儀器廠），全自動酶標儀（美國Thermo公司），低溫冷凍離心機（美國Beckman公司）、流式細胞儀（美國Beckman公司）。

1.3 富硒板黨（BCPA）注射液

BCPA購自恩施板橋鄉(xiāng)中藥材生產(chǎn)基地，采用水提醇沉法制成含生藥30%（相當于生藥含量2 g／ml）的液體，用時以生理鹽水稀釋成0.4 g／ml，瓶裝密封消毒貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BCPA給藥及免疫注射

各年齡段組大鼠自由進食、飲水，BCPA實驗組每天腹腔按7.2 g／kg注射BCPA，對照組注射等量生理鹽水，常規(guī)飼養(yǎng)連續(xù)45 d。1 mg／ml的KLH與1%佐劑按1∶3充分混勻用于免疫注射，在BCPA給藥后的第15天，按250μg／kg體重對大鼠進行皮下注射［6，7］。

1.5 遲發(fā)型免疫應答的誘導

BCPA給藥后的第22天，使用微米千分尺測量各年齡組大鼠左、右耳的厚度（精確到μm）。后將KLH用磷酸緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）配制成1μg／ml使用液，每只大鼠右耳皮內(nèi)注射20μl，左耳注射20μl PBS。注射后12 h、24 h再分別測量各組大鼠耳的厚度，按△注射KLH的耳朵厚度-△注射PBS的耳朵厚度，△＝注射后的耳朵厚度-注射前的耳朵厚度，作為遲發(fā)型免疫（delayed-type hypersensitivity，DTH）應答的計算公式［6，7］。

1.6 KLH抗原特異性IgG、IgG1及IgG2α檢測

BCPA給藥前、給藥后的第15天、30天及45天尾靜脈采集各年齡組大鼠血液，置于促凝管中，4℃，10 000 r／min離心12 min，于-80℃保存?zhèn)溆?。KLH抗原特異性IgG、IgG1及IgG2α的ELISA檢測方法及實驗步驟參考文獻［6，7］。

1.7 脾細胞中主要T細胞亞群的分析

麻醉大鼠后經(jīng)75%乙醇消毒，打開腹部小心取出脾臟，剪除周圍結(jié)締組織，放入培養(yǎng)皿中，加入10 mmol／L PBS緩沖液（pH 7.4）反復沖洗后轉(zhuǎn)至 200目濾網(wǎng)培養(yǎng)皿中，仔細研磨制成單個細胞懸液。2 000 r／min離心12 min，棄上清后加入5 ml紅細胞裂解液，1 500 r／min離心 8 min，再棄上層清液，重復 3次。沉淀用無血清DMEM培養(yǎng)液離心洗滌3次后重懸于PBS緩沖液，調(diào)整細胞濃度為2×107celles／ml，臺盼藍（Trypan Blue）細胞活性檢測。依據(jù)檢測的T細胞亞群的不同，加入50μl稀釋后的用PE標記抗大鼠CD3、CD8及用FITC標記抗大鼠CD4、CD44一抗1μg在相應的流式細胞檢測管中，對照管則加入50μl緩沖液。各管再分別加入50μl細胞懸液混勻4℃孵育半小時，離心洗滌3次，取500μl用于流式細胞儀檢測。

1.8 脾細胞增殖實驗

脾細胞獲取后（采集方法同上）將沉淀重懸于含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度為 1×106cells／ml，臺盼藍（Trypan Blue）細胞活性檢測。將上述細胞加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每個標本設(shè)3個孔，每板設(shè)陰性對照。分別加入T細胞有絲分裂原 ConA（10μg／ml）、B細胞有絲分裂原 LPS（5 μg／ml）及特異性抗原 KLH（100μg／ml）參考文獻［6，7］于CO2培養(yǎng)箱孵育后，在490 nm波長下檢測吸光度。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 DTH反應

對不同年齡段BCPA實驗組與對照組大鼠誘發(fā)DTH實驗結(jié)果表明：12、24 h的 DTH應答，年輕、中年組大鼠BCPA實驗組與對照組DTH反應均無顯著差異。老齡大鼠BCPA實驗組DTH反應相對對照組而言則明顯增強（P＜0.05，表 1）。

Tab.1 DTH responses of young，middle age and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（μm，，n＝10）

Tab.1 DTH responses of young，middle age and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（μm，，n＝10）

DTH：Delayed-type hypersensitivity*P＜0.05 vs aged rats control group

Group 12 h 24 h Young rats control 118±49 147±35 Young rats BCPA 140±32 145±42 Middle-aged rats control 217±44 108±28 Middle-aged rats BCPA 231±49 128±53 Aged rats control 46±24 76±22 Aged rats BCPA 227±61* 156±25*

2.2 KLH抗原特異性 IgG、IgG1及 IgG2α抗體分析

不同年齡段BCPA實驗組及對照組的抗KLH特異性抗體分析結(jié)果如表2所示：特異性IgG、IgG1及IgG2α抗體年輕BCPA實驗組與對照組之間無顯著性差異；中年BCPA實驗組較對照組IgG1有顯著增高現(xiàn)象（P＜0.05），但 IgG、IgG2α無顯著性差異；老齡組三種特異性抗體BCPA實驗組較對照組都有明顯增高現(xiàn)象（P＜0.05），表明BCPA能有效提高老齡大鼠的免疫功能及對抗原的應答反應。

2.3 BCPA對脾細胞中主要T細胞亞群的影響

運用流式細胞儀對各年齡段大鼠脾細胞CD3＋T淋巴細胞、CD8＋細胞毒性T淋巴細胞、CD4＋輔助T淋巴細胞和CD44＋記憶性T淋巴細胞分析，結(jié)果表明：CD8＋細胞毒性T淋巴細胞在年輕、中年BCPA實驗組較對照組無明顯變化；CD3＋T淋巴細胞、CD4＋輔助T淋巴細胞年輕組無顯著差異，但在中年組、老齡組中有顯著變化（P＜0.05）；CD44＋記憶性T淋巴細胞中年BCPA實驗組較對照組有明顯升高現(xiàn)象（P＜0.05，表 3）。

Tab.2 Anti-KLH IgG，IgG1 and IgG2α isotype responses of young，middle age and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（，n＝10）

Tab.2 Anti-KLH IgG，IgG1 and IgG2α isotype responses of young，middle age and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（，n＝10）

*P＜0.05 vs control group

Group Time（d） IgG（OD） IgG1（OD） IgG2α（OD）Young rats control 0 0.48±0.04 0.22±0.02 0.35±0.02 15 0.46±0.11 0.23±0.02 0.34±0.03 30 1.21±0.23 1.51±0.11 0.76±0.12 45 0.91±0.29 1.68±0.12 0.81±0.09 Middle-aged rats control 0 0.48±0.05 0.23±0.01 0.34±0.01 15 0.47±0.12 0.21±0.02 0.32±0.02 30 1.12±0.24 1.48±0.09 0.85±0.09 45 0.87±0.31 1.56±0.13 0.82±0.08 Young rats BCPA 0 0.48±0.05 0.21±0.01 0.36±0.02 15 0.47±0.09 0.22±0.02 0.37±0.01 30 0.87±0.13 0.46±0.11 0.45±0.05 45 1.22±0.23 0.56±0.12 0.57±0.06 Middle-aged rats BCPA 0 0.46±0.04 0.19±0.02 0.38±0.03 15 0.47±0.08 0.21±0.03 0.39±0.02 30 0.89±0.15 1.12±0.21*0.58±0.14 45 1.26±0.25 1.71±0.32*0.86±0.15 Aged rats control 0 0.35±0.03 0.09±0.01 0.26±0.03 15 0.39±0.07 0.12±0.02 0.27±0.02 30 1.18±0.15 1.46±0.09 1.37±0.12 45 1.43±0.13 1.86±0.08 1.52±0.16 Aged rats BCPA 0 0.36±0.04 0.11±0.02 0.28±0.05 15 0.35±0.08 0.13±0.02 0.29±0.04 30 1.42±0.13*2.24±0.11*1.58±0.17*45 1.85±0.12*2.18±0.07*2.13±0.23*

Tab.3 Flow cytometry assays of cellular composition of splenocytes fromyoung，middle-age rats and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（cells／makers，，n＝10）

Tab.3 Flow cytometry assays of cellular composition of splenocytes fromyoung，middle-age rats and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（cells／makers，，n＝10）

*P＜0.05 vs control group

Group CD3＋ CD8＋ CD4＋ CD44＋Young rats control 40.8±1.4 21.8±1.3 20.7±1.4 40.8±1.6 Young rats BCPA 42.1±1.9 22.4±2.1 24.2±2.4 43.1±1.7 Middle-aged rats control 35.6±1.6 20.7±1.9 18.8±1.0 34.2±1.4 Middle-aged rats BCPA 41.5±1.2* 22.8±1.1 23.2±0.7* 42.1±1.2*Aged rats control 36.7±1.5 23.2±2.2 17.9±0.8 35.8±2.1 Aged rats BCPA 44.6±2.4* 24.5±2.5 20.6±1.5*42.1±2.6

2.4 BCPA對脾細胞中增殖的影響

脾細胞懸液在特異性抗原 KLH、T細胞絲裂原ConA和B細胞絲裂原 LPS作用下增殖，結(jié)果表明：特異性抗原KLH、T細胞絲裂原ConA及B細胞絲裂原LPS對年輕BCPA實驗組脾細胞有很強的增殖反應（P＜0.05），增殖反應在中年、老齡 BCPA實驗組和對照組之間無明顯變化（表4）。

3 討論

衰老是生物自發(fā)必然的生理現(xiàn)象，可表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)上的退行性變，機能的衰退，適應性及抵抗力下降，目前對衰老有多種假說，其中之一為免疫學說［6］。免疫衰老是極為復雜的過程，常常會伴隨免疫學指標的改變，其機制目前尚不明確［7］。免疫衰老最常見的改變是T細胞和B細胞數(shù)量和功能的減退［8］，DTH應答功能會隨年齡的增加而減退，其反應是衡量體內(nèi)T細胞介導免疫反應的指標。脾臟作為機體最大的外周免疫器官，在體液免疫及細胞免疫中也有重要作用［9］，免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）則是評價機體體液免疫狀況的常用指標，其含量多少基本可反映機體免疫應答能力和體液免疫水平。

Tab.4 Proliferative responses of splenocytes from young，middleage rats in and aged rats in control group or BCPA experimental group（，n＝10）

Tab.4 Proliferative responses of splenocytes from young，middleage rats in and aged rats in control group or BCPA experimental group（，n＝10）

*P＜0.05 vs control group

Group KLH（OD） ConA（OD） LPS（OD）Young rats control 0.52±0.02 0.48±0.31 0.49±0.02 Young rats BCPA 0.61±0.03*0.64±0.18*0.62±0.01*Middle-aged rats control 0.46±0.03 0.47±0.04 0.48±0.06 Middle-aged rats BCPA 0.51±0.02 0.51±0.17 0.52±0.03 Aged rats control 0.47±0.02 0.42±0.05 0.49±0.04 Aged rats BCPA 0.49±0.04 0.47±0.03 0.53±0.01

本研究中老齡組BCPA實驗組DTH反應明顯增強，提示BCPA有利于增強T細胞介導的免疫反應，具有抵抗免疫衰老的特征，可以減少因免疫衰老所致個體的發(fā)病率及死亡率，表明BCPA能有效增強T淋巴細胞的活性，促進其增殖、分化，與詹光杰［10］研究一致；KLH是一種海洋原始腹足類 Megathura crenulata血淋巴液中的呼吸蛋白，它可顯著刺激人和動物的免疫功能，具有很好的激活作用，常做免疫增強劑［11］。特異性抗原KLH實驗結(jié)果表明BCPA能促進老齡大鼠產(chǎn)生相應的 IgG、IgG1及 IgG2α抗體，雖在年輕組中不明顯，但能顯著促進老齡大鼠的體液免疫應答能力、增強體液免疫功能，尤其是IgG1及IgG2α水平的顯著提高表明能夠促進Th1和Th2型免疫應答；CD4＋輔助T淋巴細胞、CD3＋T淋巴細胞在老齡大鼠中明顯升高，表明BCPA可以改善老齡大鼠的脾臟功能，影響T細胞亞群的比例，具有調(diào)節(jié)機體免疫平衡的功能，鐘靈［12］等研究認為板黨多糖通過提高機體抗氧化能力，抑制自由基對胰島β細胞的破壞而增強免疫力，其內(nèi)在機制還待進一步研究；尹劍春［13］認為由ConA誘導引起脾細胞的增殖能反應T細胞的功能狀態(tài)，可用來觀察機體免疫功能，在本實驗中BCPA能有效促使年輕組大鼠脾細胞增殖，然而中年組和老齡組大鼠脾細胞增殖不明顯，說明隨年齡的增長，機體免疫能力出現(xiàn)了下滑，另一方面表明BCPA或許不是通過細胞增殖的途徑來改善老齡群體體液和細胞免疫功能的。

［1］ 肖本見，陳國棟，蘭宗平.富硒板黨地上部分對小鼠益智和低氧／復氧損傷的保護作用的研究［J］.中藥材，2005，28（8）：688～690.

［2］ 郭 美，劉麗莎，何 敏，等.黨參抗衰老作用的研究進展［J］.中國老年學雜志，2013，33（5）：1205～1207.

［3］ 夏正東，王振富，鐘 靈，等.富硒板黨抗疲勞和抗缺氧作用的實驗研究［J］.中國應用生理學雜志，2014，30（2）：156～158.

［4］ 譚文波，袁德增，楊付明.富硒板黨酒對衰老大鼠睪丸的影響［J］.中國應用生理學雜志，2013，29（2）：123～125.

［5］ 王振富，鐘 靈，肖本見.富硒板黨對力竭運動大鼠心肌線粒體抗氧化作用的影響［J］.中國應用生理學雜志，2013，29（2）：177～178.

［6］ 蘆琳琳.紅景天苷的抗衰老作用：口服紅景天苷改善老齡大鼠免疫反應和增強谷氨酸半胱氨酸連接酶活性［D］.青島，中國海洋大學，2013：37～53.

［7］ 原江水.白藜蘆醇對大鼠的抗衰老作用研究［D］.青島，中國海洋大學：2013：37～52.

［8］ 候 茜，郭 美，張 帆.黨參水煎劑對D-半乳糖致免疫衰老小鼠胸腺功能的影響［J］.細胞與分子免疫學雜志，2014，30（1）：55～57.

［9］ 陳昌友，朱華亭，邱玉華.B淋巴細胞與免疫老化［J］.細胞與分子免疫學雜志，2010，26（2）：198～199.

［10］詹光杰，楊年安，肖本見.五鶴續(xù)斷抗小鼠衰老的作用及其機制研究［J］.中國應用生理學雜志，2014，30（2）：174～177.

［11］任洪林，柳增善，王克堅.鮑免疫相關(guān)基因和蛋白的研究進展［J］.遺傳，2009，31（4）：348～358.

［12］鐘 靈，王振富，李玉山.板黨多糖對小鼠實驗性糖尿病的改善作用［J］.中國應用生理學雜志，2014，30（3）：241～243.

［13］尹劍春.游泳運動對衰老大鼠免疫功能的影響［J］.中國應用生理學雜志，2008，24（4）：498～512.