胡慧仙 徐晗

骨髓造血干細胞調(diào)控及其研究進展

胡慧仙 徐晗

在多細胞生物的組織中，干細胞群對于組織結(jié)構(gòu)和功能的維持是十分重要的。目前，成體干細胞（SSC）已經(jīng)在多種具有自我更新功能的組織器官中得到鑒定，如腸上皮、表皮及造血系統(tǒng)等。定植在骨髓中的成熟造血干細胞（HSC）是SSC中的重要部分，可以持續(xù)不斷地產(chǎn)生各譜系的造血細胞并釋放入外周血[1]。HSC具有干細胞的兩大特性，即自我更新和多向分化。HSC的自我更新通過兩種不同的細胞分裂方式來完成，一種是對稱分裂，即兩個子代細胞均保持干細胞特性，理論上這種分裂方式有助于維持干細胞池中HSC數(shù)量的恒定，當機體造血系統(tǒng)受到損害或移植術(shù)后這種分裂方式對于補充HSC的數(shù)量尤為重要；另一種方式是不對稱分裂，即其中一個子代細胞仍然維持干細胞特性，另一個子代細胞則多向分化成造血細胞成分。自我更新是維持HSC壁龕的關(guān)鍵性因素，也是發(fā)揮長期造血功能的先決條件。本文就HSC的調(diào)控及相關(guān)細胞因子、骨髓微環(huán)境和信號通路在調(diào)控中的作用作一綜述。

1 造血細胞因子在HSC調(diào)控中的作用

生物個體發(fā)育中，絕大多數(shù)SSC群都依賴著較保守的信號作用的調(diào)節(jié)。HSC的調(diào)控處于動態(tài)平衡，在多種不同外界條件刺激下，如正常生理情況下的歸巢，急性失血或者感染時，造血功能必須及時進行精密調(diào)控以滿足需要。無論是生理情況還是病理情況下，內(nèi)在和外在的信號都毫無疑問地參與了HSC的調(diào)節(jié)過程[2-3]。目前已有多種HSC的關(guān)鍵調(diào)控因子被鑒定，包括細胞因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、細胞周期調(diào)控因子等。

在經(jīng)典的造血細胞因子中，起著正性調(diào)節(jié)作用的最重要的細胞因子是促血小板生成素（TPO）和血清干細胞因子（SCF）。在體外利用多種造血細胞因子如IL-3、IL-6、IL-11以及FMS樣的酪氨酸激酶3（Flt-3）配體、TPO、SCF擴增HSC的方法已被眾多學(xué)者證實。大多數(shù)情況下，HSC擴增失敗的主要原因是HSC的體外分化導(dǎo)致的造血重建能力喪失。有研究顯示[4]，通過加入IL-11、Flt-3配體和SCF并體外培養(yǎng)10d左右可適當擴增小鼠HSC，但是同樣的方法用來培養(yǎng)胎肝來源的HSC卻未能成功，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)此結(jié)果可能與長期的HSC（LT-HSC）表面并不存在Flt-3受體有關(guān)[5-6]。另外，gp130蛋白作為IL-6和IL-11受體的組成部分，在HSC的自我更新中起著一定的作用[7]。近幾年通過純化小鼠HSC等研究發(fā)現(xiàn)，SCF受體c-kit和TPO受體cmpl同時表達于HSC的表面[8-11]，且TPO或c-mpl發(fā)生基因突變的小鼠會出現(xiàn)HSC的減少。也有報道稱TPO具有維持HSC生存活力和抑制HSC凋亡等作用[12]。因此，TPO的主要功能在于抑制HSC細胞凋亡，其作用機制可能與細胞因子信號通路抑制劑Lnk有關(guān)。研究顯示Lnk缺乏的小鼠可出現(xiàn)HSC數(shù)量的增加和造血重建功能的增強，TPO和Lnk在調(diào)控HSC自我更新方面起著相反的作用，且Lnk在TPO信號調(diào)節(jié)中也起到了強有力的抑制作用[13-14]。

2 HSC壁龕-成骨細胞在HSC調(diào)控的作用

對骨髓中造血細胞的空間結(jié)構(gòu)研究后發(fā)現(xiàn)，原始的造血細胞與骨內(nèi)膜非常貼近，而定向分化的細胞多位于股骨的縱向骨髓腔[15-17]。早在1978年，Schofield[18]就提出了壁龕的假說，認為其所形成的生理性微環(huán)境可以支持干細胞的生長。通過HSC及其所處的微環(huán)境的相互作用來研究干細胞的發(fā)育、增殖以及分化等生理過程一直是HSC研究的熱點。由于哺乳動物干細胞壁龕解剖結(jié)構(gòu)上的復(fù)雜性，其內(nèi)部的組成成分在細胞水平和分子水平上尚未研究清楚。長期以來，造血微環(huán)境被認為是由血竇內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、巨噬細胞以及細胞外基質(zhì)等構(gòu)成的，成骨細胞僅僅起到一個支持保護造血微環(huán)境結(jié)構(gòu)的作用。近年來，越來越多的證據(jù)指出，定位于骨內(nèi)膜表面的間葉細胞來源的成骨細胞，是HSC壁龕中的重要組成部分[19-21]，對HSC的發(fā)育、增殖、分化和成熟起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。Calvi等[15]在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)成骨細胞的增多會引起HSC數(shù)量的相應(yīng)增多。更重要的是，該研究提出成骨細胞在甲狀旁腺激素的刺激下引起Notch1激活劑Jagged1等表達的上升，最終導(dǎo)致Notch1信號通路的激活而引起HSC數(shù)量的增加。Visnijic等[22]采用轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究成骨細胞和造血的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)給予小鼠更昔洛韋去除所有成熟和未成熟的成骨細胞8d后，骨髓中B細胞和紅系祖細胞明顯減少，同時伴有HSC數(shù)量進行性下降以及髓外造血的出現(xiàn)，髓外造血最終使得小鼠免于造血衰竭死亡。而停止給予更昔洛韋后，轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)骨吸收顯著增多，并在骨髓中重建了正常造血。該研究說明成骨細胞對于骨髓中HSC增殖和干細胞池的維系起著重要的調(diào)節(jié)作用，同時也印證了此種調(diào)控主要依賴于成熟的成骨細胞。Zhu等[23]對去卵巢大鼠造血功能的研究也顯示，與同期對照比較，去卵巢12周后大鼠成骨細胞和造血組織容量均明顯減少（P＜0.01），兩者呈正相關(guān)（r= 0.506，P＜0.01），認為成骨細胞的減少可能是骨髓造血功能減低的關(guān)鍵。Arai等[24]的研究說明促血管生成素1（Ang1）/Tie2信號對骨髓壁龕中處于靜止狀態(tài)的G0期HSC數(shù)量的維持是十分關(guān)鍵的，Ang1表達于成骨細胞表面，其受體Tie2是一種酪氨酸激酶受體，表達于內(nèi)皮細胞和HSC表面。Tie2+的HSC可能通過與N-鈣粘蛋白（N-cadherin）相關(guān)的機制而黏附于表達Ang1的成骨細胞。只有與成骨細胞密切接觸的造血干細胞才處于靜止狀態(tài)，才能維持干細胞的原始特性。Suzuki等[25]用綠色熒光蛋白基因插入標記檢測HSC的定位，觀察到了活體內(nèi)HSC孤立地分散于骨髓內(nèi)膜表面，成骨細胞與之直接黏附，并受成骨細胞的調(diào)控。Taichman[26]的研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，當供者的造血干/祖細胞進入受者骨髓后，原始HSC亞群細胞選擇性地分布在骨內(nèi)膜鄰近成骨細胞區(qū)，并受成骨細胞的調(diào)控，而定向祖細胞群則遠離骨內(nèi)膜而靠近中央血管區(qū)，并開始不斷地分裂、分化及成熟，這種不同細胞的定位分布，進一步證明了成骨細胞對于HSC原始性狀維持的調(diào)節(jié)作用。

盡管成骨細胞是HSC壁龕的重要組成部分，但它們并不是發(fā)揮調(diào)控作用的唯一細胞。除了可溶性因子外，基質(zhì)成分及其他的組織細胞均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能。例如骨橋蛋白，是由成骨細胞合成的一種基質(zhì)糖蛋白，對HSC發(fā)揮著負性調(diào)控作用[27-28]。此外，缺乏鈣敏感性受體的HSC無法定位于壁龕的骨內(nèi)膜表面[29]，揭示了局部鈣濃度會影響到HSC與骨內(nèi)膜之間的物理性黏附作用。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，功能缺損的壁龕會引起其中HSC的混亂，也更進一步強調(diào)了HSC壁龕中各種調(diào)控作用的重要性[30-31]。

3 信號通路在HSC調(diào)控的作用

3.1 成骨細胞通過Notch信號通路參與HSC調(diào)控 Notch信號通路是胚胎發(fā)育調(diào)控的保守通路，由5個跨膜配體和4個受體組成。Notch受體胞外區(qū)與相應(yīng)配體結(jié)合后，受體蛋白發(fā)生裂解，釋放出胞內(nèi)活性片段（NICD）進入細胞核，進而啟動下游靶基因的表達調(diào)控。Notch信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有非常重要的地位，有研究表明Notch相關(guān)染色體異位在T細胞白血病的發(fā)生中起到了重要作用[32]。Radtke等[33]研究表明Notch在淋巴細胞增殖過程中具有關(guān)鍵性作用，激活的Notch信號可誘導(dǎo)向T淋巴細胞分化。同時也發(fā)現(xiàn)Notch信號對于HSC的生物學(xué)特性有一定程度的影響，Notch配體家族成員如Delta和Jagged均可促進小鼠和人造血祖細胞的體外擴增[34-35]，而且Notch信號通路或者下游蛋白Hes1的激活可以促使LT-HSC自我更新能力的增強，甚至延長原始造血祖細胞的生存周期[36]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路作用與Hes1在HSC中高水平表達有關(guān)，而在更成熟的造血祖細胞表面呈低水平表達，這種差異表達說明Notch信號的阻斷可加速HSC的分化，同時也說明Notch信號通路對HSC的“干細胞”狀態(tài)維持非常重要。為進一步闡明Notch信號通路在HSC中的作用，Duncan等[37]通過阻斷HSC中的Notch通路以檢測干細胞重建造血系統(tǒng)的能力，結(jié)果亦顯示活化的Notch信號能抑制HSC分化，維持其多項潛能性。另外，Calvi等[15]的研究進一步明確了成骨細胞作為HSC壁龕重要組成成分在造血中的作用，同時也表明了活化的甲狀旁腺激素受體能使成骨細胞高表達Jagged1蛋白，從而促進了原始造血細胞的自我更新。因此，成骨細胞不僅作為HSC壁龕的一部分，而且它們可以通過激活Notch/Jagged信號通路來調(diào)控HSC的自我更新[36]。研究和利用Notch信號通路對于今后臨床上用于HSC體內(nèi)擴增具有十分重要的意義。

3.2 Wnt信號通路促進HSC的自我更新 Wnt信號通路不僅是發(fā)育學(xué)，同時也是腫瘤生物學(xué)的研究熱點。最早對Wnt通路的了解來自對致癌病毒和果蠅發(fā)育機制的研究。Wnt信號通路的啟動激活是由其配體與卷曲蛋白（Fz）家族成員的七螺旋跨膜區(qū)及低密度脂蛋白（LRP）家族中的LRP5/6的共受體相結(jié)合而完成的[8，29]。當Fz與LRP共同結(jié)合Wnt信號時則啟動了經(jīng)典Wnt信號通路。經(jīng)典的Wnt信號途徑是通過β-鏈蛋白（β-catenin）和T細胞因子（TCF）發(fā)揮作用的，而一些Wnt蛋白如Wnt4和Wnt5a，不需LRP5/6參與，只與Fz結(jié)合即可激活其他信號通路，即非經(jīng)典Wnt信號途徑，其主要包括planar細胞極性（PCP）通路、Wnt-Ca2+途徑以及最新發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶A通路[8，17，38]。Austin等[39]早在1997年即提出Wnt信號對小鼠HSC具有一定的調(diào)控作用，當時研究胎兒時期造血功能時發(fā)現(xiàn)多種Wnt家族蛋白的表達，并且認為Wnt5a可在體外刺激和誘導(dǎo)早期造血干/祖細胞的增殖和自我更新。Willert等[40]研究發(fā)現(xiàn)純化Wnt3a同樣可以增加小鼠中晚期成熟HSC自我更新的能力。Van等[41]通過免疫表型和克隆形成分析后認為Wnt家族蛋白對HSC的正性調(diào)節(jié)作用并不是小鼠種系所獨有的，人的Lin-CD34+細胞群在Wnt蛋白的作用下也可以在體外增殖。不僅僅是體外實驗的證據(jù)支持Wnt蛋白可促使HSC增殖，Wnt蛋白家族成員也存在于人胚胎時期和成年時期的骨髓基質(zhì)中，且研究證實Wnt5a可表達于原始的Lin-CD34+細胞上。由此可知，Wnt蛋白可能是通過旁分泌或自分泌的相關(guān)機制來影響HSC的。

到目前為止，Wnt蛋白對HSC作用的細胞內(nèi)機制仍不清楚，Reya等[42]的研究認為活化的Wnt信號通路能上調(diào)β-catenin、Notch1和同源盒基因（Hox）家族成員HoxB4基因的表達，從而促進HSC數(shù)量的倍增，用可溶性的Wnt蛋白拮抗劑能使HSC的增殖能力降低，進一步的說明Wnt蛋白與HSC存在一定的相互關(guān)系。然而Kirstetter等[43]研究則認為當β-catenin在體內(nèi)表達受到基因座ROSA26的調(diào)控時，并不能引起HSC自我更新能力的增強，有關(guān)Wnt通路對HSC的調(diào)節(jié)作用機制有待進一步研究。

3.3 Wnt和Notch信號協(xié)同促進HSC的自我更新 Wnt和Notch都是影響造血干細胞功能的重要通路，眾多實驗揭示造血微環(huán)境中的大多數(shù)細胞其Notch和Wnt信號都是活化的，且多數(shù)細胞的生理活動往往同時利用這兩條信號通路。Duncan等[37]研究顯示用Wnt3a刺激HSC后，HSC中Notch信號的活性上調(diào)，同時Notch信號通路的下游靶基因如Hesl和Dtxl也同時上調(diào)，提示W(wǎng)nt信號通路對HSC中Notch信號通路靶基因差異表達也起了重要作用。Artavanis等[44]認為Notch和Wnt信號通路是相互聯(lián)系的，它們之間存在交叉，如Wnt通路下游活化蛋白Dsh，其氨基端能與Notch受體羧基端結(jié)合，從而影響活化的NICD的形成和向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。Duncan等[37]研究報道當骨小梁中一部分細胞受到激活信號刺激時，可引起Wnt和Notch信號通路的同時激活，協(xié)同維持HSC池的特性。雖然Wnt和Notch信號通路均可以促進HSC的自我更新，但Duncan等認為兩者是通過不同的機制來實現(xiàn)的。當Wnt信號導(dǎo)致小鼠骨髓干細胞（LSK細胞）出現(xiàn)增殖時，Notch信號對此功能的抑制作用并沒有出現(xiàn)；相反，Notch信號發(fā)揮功能以維持未分化的HSC的特性時，Wnt蛋白也不影響其作用。這些結(jié)果提示W(wǎng)nt和Notch信號通路可以共同促進HSC的自我更新。此外，有觀察發(fā)現(xiàn)Wnt3a蛋白可調(diào)控Notch靶基因的表達，且Wnt和Notch的靶基因均通過抑制Wnt信號通路中的GSK-3而影響HSC的生物學(xué)作用，這些發(fā)現(xiàn)提示兩條信號通路可能同時處于一個復(fù)雜的信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中而共同調(diào)控HSC池[45]。

4 結(jié)語

HSC作為具有廣闊臨床應(yīng)用前景的種子細胞，在各個領(lǐng)域已得到廣泛重視。其生物學(xué)特性如自我更新和多向分化，受到所處在的造血微環(huán)境中各種基質(zhì)細胞及其分泌的細胞因子的精密調(diào)控，多條細胞內(nèi)及細胞外的信號通路也參與了HSC結(jié)構(gòu)和功能的維持。目前對于HSC的多種調(diào)控作用的內(nèi)在機制尚不十分清楚，其失控很可能是導(dǎo)致多種疾病，如各種類型白血病、骨髓增殖性疾病等的關(guān)鍵性因素。故對其內(nèi)在機制的深入分析可以為將來研究多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程提供更多的理論依據(jù)。

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2013-10-11）

（本文編輯：胥昀）

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