綜述, 審校

(南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所,湖南衡陽421001)

疫苗被廣泛用于人類和動(dòng)物預(yù)防感染性疾病。一種疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答獲得保護(hù)與適當(dāng)?shù)淖魟┘案咝У目乖f送系統(tǒng)密切相關(guān)。近年來一些合成的物質(zhì)能增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答能力,如脂質(zhì)體、質(zhì)粒DNA(pDNA)。脂質(zhì)體由單層或多層磷脂膜組成,是一種有效的傳遞系統(tǒng),但可能產(chǎn)生非特定的免疫刺激性信號(hào)和難以預(yù)料的不利作用[1];pDNA疫苗使用簡單,發(fā)展?jié)摿薮?但其本身免疫原性低,難以被細(xì)胞攝取,限制其發(fā)展與應(yīng)用。因此,開發(fā)能將抗原遞送至特定的免疫細(xì)胞并增加遞送抗原的免疫原性的新型載體系統(tǒng),仍需廣泛深入研究。菌影(bacterial ghost,BG)平臺(tái)系統(tǒng)對遞送疫苗、藥物和活性物質(zhì)是一項(xiàng)創(chuàng)新性的技術(shù)。菌影是利用噬菌體PhiX174的裂解蛋白E[2]在細(xì)胞膜上形成一個(gè)跨膜通道,細(xì)胞質(zhì)從該通道釋放后得到的革蘭陰性菌的空菌體。菌影可以裝載藥物、蛋白質(zhì)、基因、酶及其它物質(zhì),還可形成封閉的囊泡。菌影和其它非生物疫苗相比,最大的優(yōu)點(diǎn)是其具有未被破壞的完整細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),作為天然佐劑刺激宿主免疫系統(tǒng)應(yīng)答,同時(shí)遞送特異性抗原給抗原提呈細(xì)胞(APC)或者活性物質(zhì)給靶細(xì)胞[3]。生產(chǎn)菌影高效、低成本、安全,制成凍干疫苗可以在室溫下保存數(shù)月[4]。此外,菌影可采用多種免疫途徑,如皮內(nèi)、肌肉、皮下、腹膜、口服和胃等,還可通過黏膜免疫,如口腔、鼻腔、直腸、陰道或眼等[5-7]。本文重點(diǎn)闡述菌影作為亞單位蛋白疫苗和DNA疫苗的載體的特性、菌影作為人用疫苗的發(fā)展?jié)摿霸趧?dòng)物疫苗應(yīng)用方面的最新進(jìn)展。

1 菌影形成機(jī)制與制備

1.1 菌影形成機(jī)制

菌影的形成是通過控制裂解基因E的表達(dá)。該基因編碼的裂解蛋白由91個(gè)氨基酸殘基組成,通過與細(xì)菌內(nèi)膜或外膜融合,能在多種革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞膜和胞壁上形成40～200 nm的特異性跨膜孔道,包括核酸、核糖體在內(nèi)的所有細(xì)胞質(zhì)成分從跨膜通道流出,剩下的細(xì)菌空殼即為菌影。在裂解過程中菌影的細(xì)胞外膜和內(nèi)膜結(jié)構(gòu)仍保持完整。裂解蛋白E的裂解作用在細(xì)菌增殖的過程中進(jìn)行,包括裂解蛋白E在細(xì)胞內(nèi)膜聚集和裂解蛋白E構(gòu)象的改變在細(xì)胞內(nèi)外膜形成一個(gè)封閉的細(xì)胞周質(zhì)間隙。

1.2 菌影制備

裂解基因E在控制表達(dá)的情況下許多種革蘭陰性細(xì)菌可以形成菌影,包括人和動(dòng)物的非病原菌、致病菌和益生菌,如大腸桿菌菌株K12、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、出血敗血性巴氏桿菌和益生菌大腸桿菌Nissle 1917等等。菌影的形成通過其生長和凋亡期里細(xì)菌的總數(shù)、增殖的細(xì)菌數(shù)以及光密度來判斷,可用流式細(xì)胞儀來檢測裂解基因E的效率、菌影的數(shù)量以及未裂解的細(xì)菌?？刂屏呀饣駿的表達(dá)能使菌影的轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.9%,剩余的活細(xì)菌用β-丙內(nèi)酯滅活。此外,將金葡菌核酸酶A(SNUC)與裂解基因E一起表達(dá),前者可降解宿主菌DNA和其它核苷酸,以避免致病基因或抗藥基因的水平轉(zhuǎn)移帶來的相關(guān)隱患,該方法已用于痢疾志賀菌菌影制備[8-9]。

2 菌影作為蛋白亞單位疫苗和DNA疫苗的載體

2.1 菌影作為亞單位蛋白的載體

DNA重組技術(shù)已用于將外源蛋白抗原錨定在菌影胞膜復(fù)合物上來生產(chǎn)菌影,或以菌影作為亞單位蛋白疫苗的載體將外源抗原裝載于菌影殼體中[9-11]?？乖膳c菌影外膜蛋白融合呈現(xiàn)在菌影表面,或錨定在內(nèi)膜的N端、C端或N與C端的膜錨定位點(diǎn),這些錨定位點(diǎn)不影響外源性抗原的正確折疊,能保持構(gòu)象表位的結(jié)構(gòu)和酶活性物質(zhì)的所有活性。此外,將目的抗原裝載入細(xì)胞周質(zhì)間隙可防止菌影生產(chǎn)過程中環(huán)境因素和凍干所致抗原的降解。細(xì)胞周質(zhì)間隙的類凝膠區(qū)域富含膜源性低聚糖,能在細(xì)菌裂解過程中將外膜和內(nèi)膜融合而將周質(zhì)間隙緊緊封閉。獨(dú)自存在或與S層融合蛋白SbsA/SbsB結(jié)合的靶抗原,通過與麥芽糖蛋白(MalE)的融合導(dǎo)出到周質(zhì)間隙。SbsA和SbsB結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其能為菌影內(nèi)腔裝載外源抗原,SbsA比SbsB裝載外源抗原的能力更強(qiáng),因其能插入較大的片段如Omp26[12]。

2.2 菌影作為DNA編碼抗原的載體

菌影具有極強(qiáng)的裝載能力與裝載效率,能裝載大量的核酸。裝載菌影簡便,只需將凍干粉劑菌影重懸在含有高濃度的pDNA溶液中,再洗去未結(jié)合的pDNA即可。菌影裝載DNA量取決于溶液中DNA的濃度。有研究表明,一個(gè)菌影的裝載量可達(dá)6000個(gè)中等大小的質(zhì)粒[13]。質(zhì)?；蚓€性DNA與菌影胞膜之間的相互作用很可能是帶負(fù)電荷的DNA分子與帶正電荷的非極性內(nèi)膜之間的靜電作用[13]。此外,pDNA能被裝載入菌影內(nèi)并儲(chǔ)存,是因?yàn)閜DNA能與菌影內(nèi)生物素葡聚糖胺或者聚賴氨酸結(jié)合。pDNA帶有的特定DNA序列(LacOs位點(diǎn))與內(nèi)膜上的融合復(fù)合體LacI-L'膜錨點(diǎn)結(jié)合,使特異性自身固定的pDNA(pSIP)在裂解過程中被固定在細(xì)菌內(nèi)膜[14]。通過菌影遞送DNA給靶細(xì)胞有兩種機(jī)制:兩步法是先制備菌影、凍干成干粉狀,再裝載高量的目的DNA;一步法是采用pSIP系統(tǒng)直接制備帶有特異性pDNA的菌影[1]。

3 人用菌影疫苗的發(fā)展?jié)摿σ约皠?dòng)物菌影疫苗的應(yīng)用

菌影系統(tǒng)是一個(gè)新型、無生命、高效的抗原和藥物遞送平臺(tái),成為當(dāng)前開發(fā)病毒性和細(xì)菌性疫苗的重要手段。研究表明,菌影對包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞的生存能力和代謝活動(dòng)無細(xì)胞毒性或遺傳毒性[1]。菌影具有完整的外部結(jié)構(gòu),能被APC表面受體如補(bǔ)體受體和Toll樣受體有效識(shí)別并吞噬[15]。在豬體內(nèi),胸膜肺炎放線桿菌菌影能增加APC表面MHC分子的表達(dá)并顯著增加APC刺激T細(xì)胞增殖的能力[16]。DC作為專職性APC,其吞噬活性和攝取能力取決于用于制備菌影的細(xì)菌菌株。雞體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,使用非耐藥質(zhì)粒篩選的腸炎沙門菌菌影和常規(guī)途徑篩選的菌影相比,免疫保護(hù)作用相當(dāng)而生物技術(shù)安全性更高[17]。

3.1 人用菌影疫苗的發(fā)展?jié)摿?/h3>

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,菌影能引起針對菌體和目的抗原的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[18]。菌影有多種可選擇免疫途徑,如腹腔、皮內(nèi)、肌肉、皮下、胃內(nèi)、吸入或者靜脈免疫,裝載DNA的菌影在體內(nèi)轉(zhuǎn)染DC能誘導(dǎo)特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。C57BL/6小鼠肌注帶有沙眼衣原體重組外膜蛋白的霍亂弧菌菌影能引起局部黏膜和全身的Th1型免疫應(yīng)答,特異性抗原致敏的T細(xì)胞可被動(dòng)轉(zhuǎn)移[19-20]。C57BL/6小鼠肌注表達(dá)沙眼衣原體孔蛋白B和多態(tài)性膜蛋白D的霍亂弧菌菌影后,能誘導(dǎo)持續(xù)強(qiáng)烈的系統(tǒng)和黏膜記憶性免疫應(yīng)答[21]。用重組Omp18蛋白的幽門螺桿菌菌影對C57BL/6小鼠進(jìn)行治療性免疫,Omp18特異性抗體的增加和胃部細(xì)菌的減少與對照組差異顯著[22]。以嗜血桿菌Omp26的大腸桿菌NM522菌影通過腸黏膜和(或)肺黏膜免疫大鼠產(chǎn)生IgG2a,誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答,在Omp26支氣管內(nèi)加強(qiáng)免疫后增加更明顯,顯著清除呼吸道攻擊的細(xì)菌[12]。最近研究表明,傷寒沙門氏菌Ty21a菌影裝載HIVgp140 DNA后免疫小鼠,易被巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬并有效表達(dá),誘導(dǎo)外周和腸黏膜抗體水平明顯高于裸露DNA免疫組小鼠[23]。帶有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌突變基因msbB的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌影灌胃免疫BALB/c小鼠Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答,有效減低前炎癥細(xì)胞因子的分泌,以100倍最小致死量野毒株攻擊,獲得了80%的高保護(hù)率[24]。

以裝載編碼β-牛乳糖的pCMV的曼氏溶血桿菌菌影皮下和肌肉注射BALB/c小鼠,其體液免疫應(yīng)答水平比用裸露DNA免疫至少高出一個(gè)數(shù)量級,菌影刺激特異性Th1和Th2型免疫應(yīng)答,隨后轉(zhuǎn)換為Th2型應(yīng)答,表明用于制備菌影的細(xì)菌株能調(diào)節(jié)抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答類型[25]。進(jìn)一步研究小鼠APC,證實(shí)菌影具有強(qiáng)大的遞送編碼特異性抗原的pDNA給靶細(xì)胞的功能,轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞表達(dá)抗原效率高達(dá)85%[13,25]。此外,以體內(nèi)轉(zhuǎn)染裝載pCMV β-牛乳糖體曼氏溶血桿菌菌影的髓源性DC靜注小鼠,在所有免疫鼠誘生了特異性抗β-牛乳糖的抗體,而且在免疫后觀察到識(shí)別MHCⅠ-β-牛乳糖抗原表位的T細(xì)胞釋放IFN-γ水平增加[25]。胸膜肺炎放線桿菌菌影刺激豬DC的結(jié)果與曼氏溶血桿菌、霍亂弧菌菌影共同培養(yǎng)刺激小鼠相似,DC表面表達(dá)的MHC分子和共同刺激分子增加[25]。定量分析菌影的加載量表明,低濃度的DNA(50質(zhì)粒/菌影)就足夠有效遞送給靶細(xì)胞,其轉(zhuǎn)染率高達(dá)82%[26]?？紤]到菌影DNA大加載量(6000質(zhì)粒/菌影)和最低濃度DNA即可成功轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞(50質(zhì)粒/菌影),菌影內(nèi)部空間的高載荷量表明它們能運(yùn)載多種編碼不同種類的抗原的質(zhì)粒和(或)其它的免疫活性物質(zhì)。

不同菌株的菌影能誘導(dǎo)不同動(dòng)物模型和不同靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答,表明菌影能特異性刺激抗菌影的細(xì)菌株的有效體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,菌影運(yùn)載和遞送給靶細(xì)胞的抗原足能保護(hù)動(dòng)物抗特異性菌株的攻擊感染。菌影可制備為不同的形式(氣溶膠、食物和液體)、可采用多種免疫途徑及上述的各種免疫刺激能力的這些特性,表明菌影有希望發(fā)展為多價(jià)疫苗。評價(jià)菌影免疫動(dòng)物的結(jié)果有助于選擇最合適用做菌影的菌株,以刺激最有效的免疫應(yīng)答類型抗特定疾病(病原體)。

3.2 獸類菌影疫苗

免疫途徑在獸醫(yī)實(shí)踐應(yīng)用中極其重要。疫苗最好的免疫途徑是黏膜免疫,如口腔,鼻吸,眼內(nèi)和呼吸道的免疫。黏膜免疫比其它途徑免疫有以下優(yōu)點(diǎn):使用方便,副作用少,便于多次加強(qiáng)免疫。滅活疫苗通過黏膜免疫通常不能起到全面的免疫保護(hù)作用,必須使用黏膜佐劑如去毒的不耐熱大腸桿菌毒素和霍亂毒素等來增強(qiáng)免疫作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中菌影作用于口腔、鼻腔、眼或者呼吸道的黏膜表面,在引起免疫應(yīng)答的劑量范圍內(nèi)無任何不良反應(yīng)[27]。組織培養(yǎng)試驗(yàn)顯示,即便是高劑量條件下(1000菌影/細(xì)胞),菌影也不會(huì)引起細(xì)胞毒性或遺傳毒性[28]。黏膜免疫通常需要至少一次相同疫苗來加強(qiáng)免疫以獲得完全保護(hù),這取決于菌影來源的菌株和遞送途徑。然而,使用出血性大腸桿菌菌影,一次直腸免疫即可獲得100%保護(hù)[29],因此對不同菌影的候選疫苗的劑量和免疫途徑需要深入研究。

許多致病性革蘭陰性細(xì)菌在不同的動(dòng)物模型中被應(yīng)用作為菌影。副豬嗜血桿菌菌影通過注射免疫可引起特異性IgG滴度、CD4+和CD8+T細(xì)胞比值顯著增加。在菌影刺激下豬DC表面表達(dá)共刺激分子和MHC分子明顯增加[30]。腸出血性大腸桿菌(EHEC)菌影胃內(nèi)免疫保護(hù)小鼠抗細(xì)菌的致死性攻擊感染,誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,單劑量菌影免疫可獲得86%的保護(hù)率,而增加劑量可以到達(dá)93%[31]。兔和鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示多殺性巴氏桿菌菌影和溶血二氧化碳嗜纖維菌的菌影能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體對其它巴斯德菌的血清型和野生型分離株有交叉保護(hù)作用。小鼠腹腔免疫巴氏桿菌影誘導(dǎo)完全免疫保護(hù)具有劑量依賴性[32]。在牛體內(nèi)溶血二氧化碳嗜纖維菌菌影比商品化疫苗能獲得更好的免疫保護(hù)作用[33]。

3.3 魚類菌影疫苗

魚類養(yǎng)殖業(yè)繁榮發(fā)展使得魚類生存空間狹窄,最易受愛德華氏菌和弧菌感染,而連續(xù)使用抗生素會(huì)導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生和抗生素殘留,因此發(fā)展魚類疫苗刻不容緩。愛德華氏菌影疫苗是養(yǎng)殖魚業(yè)領(lǐng)域設(shè)計(jì)和發(fā)展新型疫苗的代表,在羅非魚分別腹膜內(nèi)注射愛德華氏菌菌影和用福爾馬林滅活的愛德華氏菌,結(jié)果顯示菌影獲得了更強(qiáng)的免疫保護(hù)[34]。此外,鰻弧菌菌影研究以用于預(yù)防魚類的弧菌病[35]。使用減毒活鰻弧菌為菌影被用于設(shè)計(jì)一種新型的減毒魚疫苗,已成功誘導(dǎo)抗弧菌的交叉保護(hù)性免疫。在這個(gè)新方法中,將攜帶裂解E基因的減毒鰻弧菌喂給魚類,使E基因在魚體內(nèi)激活表達(dá),裂解減毒細(xì)菌形成菌影。這種新型疫苗有兩個(gè)主要優(yōu)點(diǎn):菌影技術(shù)保證減毒株無毒力回復(fù);外源抗原在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)或者外源抗原與主體病原菌外膜融合作為多價(jià)疫苗可誘導(dǎo)針對靶抗原和致病菌的免疫應(yīng)答。大比目魚腹腔注射非致病性活大腸桿菌多價(jià)疫苗,在裂解基因E介導(dǎo)下目的抗原在體內(nèi)釋放并引起免疫應(yīng)答。以這種疫苗免疫30天后,以嗜水氣單胞菌LSA34攻擊感染,大比目魚存活率達(dá)80%以上[19]。以上表明,菌影技術(shù)與活細(xì)菌載體聯(lián)合應(yīng)用,可開發(fā)新的疫苗類型。

4 展 望

在當(dāng)前的疫苗開發(fā)里菌影替代了傳統(tǒng)的滅活病毒和細(xì)菌的方法。菌影是一個(gè)新穎的、無生命的、高效的抗原和藥物遞送平臺(tái)。雖然菌影作為抗原載體的研究近幾年才開始,但是越來越多的學(xué)者開始關(guān)注這項(xiàng)技術(shù),它已經(jīng)顯示出很好的潛力。相信在不久的將來,菌影將在疫苗研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

[1] Muhammad A,Champeimont J,Mayr UB,et al.Bacterial ghosts as carriers of protein subunit and DNA-encoded antigens for vaccine applications[J].Expert Rev Vaccines,2012,11(1):97-116.

[2] Lubitz P,Mayr UB,Lubitz W.Applications of bacterial ghosts in biomedicine[J].Adv Exp Med Biol,2009,655:159-170.

[3] Riedmann EM,Kyd JM,Cripps AW,et al.Bacterial ghosts as adjuvant particles[J].Expert Rev Vaccines,2007,6(2):241-253.

[4] Langemann T,Koller VJ,Muhammad A,et al.The Bacterial Ghost platform system:production and applications[J].Bioeng Bugs,2010,1(5):326-336.

[5] Ekong EE,Okenu DN,Mania-Pramanik J,et al.A Vibrio cholerae ghost-based subunit vaccine induces cross-protective chlamydial immunity that is enhanced by CTA2B,the nontoxic derivative of cholera toxin[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2009,55(2):280-291.

[6] Walcher P,Cui X,Arrow JA,et al.Bacterial ghosts as a delivery system for zona pellucida-2 fertility control vaccines for brushtail possums(Trichosurus vulpecula)[J].Vaccine,2008,26(52):6832-6838.

[7] Eko FO,Okenu DN,Singh UP,et al.Evaluation of a broadly protective Chlamydia-cholera combination vaccine candidate[J].Vaccine,2011,29(21):3802-3810.

[8] Langemann T.Process development for industrial scale bacterial ghost production[D].Vienna:University of Vienna,2011.

[9] Ifere GO,He Q,Igietseme JU,et al.Immunogenicity and protection against genital Chlamydia infection and its complications by a multisubunit candidate vaccine[J].J Microbiol Immunol Infect,2007,40(3):188-200.

[10] Macmillan L,Ifere GO,He Q,et al.A recombinant multivalent combination vaccine protects against Chlamydia and genital herpes[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2007,49(1):46-55.

[11] Ramey K,Eko FO,Thompson WE,et al.Immunolocalization and challenge studies using a recombinant Vibrio cholerae ghost expressing Trypanosoma brucei Ca(2+)ATPase(TBCA2)antigen[J].Am J Trop Med Hyg,2009,81(3):407-415.

[12] Riedmann EM,Lubitz W,McGrath J,et al.Effectiveness of engineering the nontypeable Haemophilus influenzae antigen Omp26 as an S-layer fusion in bacterial ghosts as a mucosal vaccine delivery[J].Hum Vaccin,2011,7(Suppl):99-107.

[13] Paukner S,Kudela P,Kohl G,et al.DNA-loaded bacterial ghosts efficiently mediate reporter gene transfer and expression in macrophages[J].Mol Ther,2005,11(2):215-223.

[14] Mayrhofer P,Tabrizi CA,Walcher P,et al.Immobilization of plasmid DNA in bacterial ghosts[J].J Control Release,2005,102(3):725-735.

[15] Paukner S,Stiedl T,Kudela P,et al.Bacterial ghosts as a novel advanced targeting system for drug and DNA delivery[J].Expert Opin Drug Deliv,2006,3(1):11-22.

[16] Felnerova D,Kudela P,Bizik J,et al.T cell-specific immune response induced by bacterial ghosts[J].Med Sci Monit,2004,10(10):BR362-370.

[17] Jawale CV,Lee JH.Development of a biosafety enhanced and immunogenic salmonella enteritidis ghost using an antibiotic resistance gene free plasmid carrying a bacteriophage lysis system[J].PLoS One,2013,8(10):e78193.

[18] Guan L,Mu W,Champeimont J,et al.Iron-regulated lysis of recombinant Escherichia coli in host releases protective antigen and confers biological containment[J].Infect Immun,2011,79(7):2608-2618.

[19] Eko FO,Lubitz W,McMillan L,et al.Recombinant Vibrio cholerae ghosts as a delivery vehicle for vaccinating against Chlamydia trachomatis[J].Vaccine,2003,21(15):1694-1703.

[20] Ekong EE,Okenu DN,Mania-Pramanik J,et al.A Vibrio cholerae ghost-based subunit vaccine induces cross-protective chlamydialimmunity thatis enhanced by CTA2B,the nontoxic derivative of cholera toxin[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2009,55(2):280-291.

[21] Eko FO,Ekong E,He Q,et al.Induction of immune memory by a multisubunit chlamydial vaccine[J].Vaccine,2011,29(7):1472-1480.

[22] Talebkhan Y,Bababeik M,Esmaeili M,et al.Helicobacter pylori bacterial ghost containing recombinant Omp18 as a putative vaccine[J].J Microbiol Methods,2010,82(3):334-337.

[23] Wen J,Yang Y,Zhao GY,et al.Salmonella typhi Ty21a bacterial ghost vector augments HIV-1 gp140 DNA vaccine-induced peripheral and mucosal antibody responses via TLR4 pathway[J].Viccine,2012,30(39):5733-5739.

[24] Cai K,Zhang Y,Yang BY,et al.Yersinia enterocolitica ghost with msbB mutation provides protection and reduces proinflammatory cytokines in mice[J].Vaccine,2013,31(2):334-340.

[25] Ebensen T,Paukner S,Link C,et al.Bacterial ghosts are an efficient delivery system for DNA vaccines[J].J Immunol,2004,172(11):6858-6865.

[26] Kudela P,Paukner S,Mayr UB,et al.Effective gene transfer to melanoma cells using bacterial ghosts[J].Cancer Lett,2008,262(1):54-63.

[27] Jalava K,Eko FO,Riedmann E,et al.Bacterial ghosts as carrier and targeting systems for mucosal antigen delivery[J].Expert Rev Vaccines,2003,2(1):45-51.

[28] Kudela P,Koller VJ,Mayr UB,et al.Bacterial Ghosts as antigen and drug delivery system for ocular surface diseases:effective internalization of Bacterial Ghosts by human conjunctival epithelial cells[J].J Biotechnol,2011,153(3-4):167-175.

[29] Mayr UB,Kudela P,Atrasheuskaya A,et al.Rectal single dose immunization of mice with Escherichia coli O157:H7 bacterial ghosts induces efficient humoral and cellular immune responses and protects against the lethal heterologous challenge[J].Microb Biotechnol,2012,5(2):283-294.

[30] Sorochkina AI,Kovalchuk SI,Omarova EO,et al.Peptide-induced membrane leakage by lysine derivatives of gramicidin A in liposomes,planar bilayers,and erythrocytes[J].Biochim Biophys Acta,2013,1828(11):2428-2435.

[31] Mayr UB,Haller C,Haidinger W,et al.Bacterial ghosts as an oral vaccine:a single dose of Escherichia coli O157:H7 bacterial ghosts protects mice against lethal challenge[J].Infect Immun,2005,73(8):4810-4817.

[32] Marchart J,Dropmann G,Lechleitner S,et al.Pasteurella multocida-and Pasteurella haemolytica-ghosts:new vaccine candidates[J].Vaccine,2003,21(25-26):3988-3997.

[33] Marchart J,Rehagen M,Dropmann G,et al.Protective immunity against pasteurellosis in cattle,induced by Pasteurella haemolytica ghosts[J].Vaccine,2003,21(13-14):1415-1422.

[34] Kwon SR,Nam YK,Kim SK,et al.Protection of tilapia(Oreochromis mosambicus)from edwardsiellosis by vaccination with Edwardsiella tarda ghosts[J].Fish Shellfish Immunol,2006,20(4):621-626.

[35] Kwon SR,Kang YJ,Lee DJ,et al.Generation of Vibrio anguillarum ghost by coexpression of PhiX 174 lysis E gene and staphylococcal nuclease A gene[J].Mol Biotechnol,2009,42(2):154-159.