蔣聰利，劉志剛，夏立新#

(1深圳大學過敏反應與免疫學研究所，深圳 518060；2深圳大學生命科學學院，深圳 518060)

哮喘是肺部慢性炎性疾病，可引起患者氣道高反應、黏液分泌增多和氣流阻塞等[1]。近10余年來，全世界約有1億哮喘患者，哮喘已成為威脅公眾健康的主要慢性炎性疾病。當受到多種環(huán)境過敏原、運動、呼吸道病毒感染或某些刺激物影響時，哮喘可能從最初良性的間歇性發(fā)作發(fā)展為嚴重哮喘[2]。過敏性哮喘是哮喘的一種最常見類型，主要是由吸入性過敏原引起的一系列哮喘癥狀，持久的氣道炎性反應是過敏性哮喘的主要病理學改變。這些改變包括支氣管黏膜腫脹，分泌物增多，氣道內炎性細胞浸潤，氣道平滑肌痙攣等。目前，針對哮喘的治療方法主要是β-腎上腺素受體激動劑、白三烯調節(jié)劑、吸入糖皮質激素，避免過敏原和刺激物，或進行免疫治療，但上述方法周期較長且療效短暫，至今尚不能抑制哮喘發(fā)生或完全治愈[3]。

哮喘發(fā)生的根本原因尚未闡明，多數(shù)治療手段仍為對癥治療。研究過敏性哮喘發(fā)病機制需涉及組織學、分子和基因變化及蛋白表達，而microRNA(miRNA)是基因表達的重要調控因子，自10年前在哺乳動物細胞中被發(fā)現(xiàn)后，其在許多人類疾病中的作用逐漸凸顯[4]；miRNAs在哮喘病因學的研究中也逐漸受到重視，其可能為過敏性哮喘的病理研究和治療方法帶來根本性改變。

miRNA的生物起源和作用機制

miRNA是真核生物體內具有調控功能的一類非編碼RNA，主要位于基因組的內含子、外顯子及基因間隔區(qū)。類似于mRNA，miRNA在細胞核內由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ轉錄，最初產(chǎn)物pri-miRNA具有5’端帽子結構和3’端多聚腺苷酸尾巴的獨特結構。pri-miRNA在核酸酶Drosha和輔助蛋白的共同作用下形成約70 nt的莖環(huán)結構，其突出特征是莖環(huán)結構處具有未完全配對的堿基，且在3’末端有2個突出的核苷酸。pri-miRNA的莖環(huán)結構被細胞核運輸?shù)鞍譋xportin5識別，與RNA-GTP結合后將pri-miRNA運送至細胞質。隨后，在RNAseIII、Dicer、雙鏈RNA結合蛋白TRBP的作用下，pri-miRNA被切割成約為22個堿基對的雙鏈miRNA。成熟miRNA中的1條鏈合并至沉默復合體中，成熟miRNA即可通過堿基互補配對實現(xiàn)對基因表達的調控[5-7]。miRNA可能有數(shù)百個靶基因，1個靶基因也可能由大量的miRNA調控，從而形成了復雜的基因調控網(wǎng)絡。miRNA還可通過表觀遺傳機制(如DNA甲基化、組蛋白乙酰化)或調控轉錄因子影響整體基因表達[8]。因此，miRNAs可能是調控過敏性炎性反應的一類最具研究潛力的重要分子。

miRNA在過敏性哮喘中的功能

輔助T淋巴細胞極化和輔助T2淋巴細胞型細胞因子調節(jié)

T淋巴細胞是過敏性疾病患者參與機體免疫應答的重要細胞成分。Muljo等[9]構建了缺失RNAs和miRNAs加工酶Dicer的小鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)Dicer酶缺失后T淋巴細胞發(fā)育受損，數(shù)量減少且趨向凋亡；輔助T(helper T，Th)細胞增殖減弱，且偏向于表達Th1型細胞因子干擾素-γ。目前，多數(shù)研究主要集中在單個miRNA對調節(jié)Th細胞分化和激活的影響。在Th細胞的發(fā)育過程中，miRNA-181a能夠增強T淋巴細胞對外界抗原的敏感性，若抑制未成熟T淋巴細胞中miRNA-181a的表達，可降低抗原敏感性、破壞Th細胞的選擇性，在miRNA-181a/b缺失的小鼠模型中，一系列T淋巴細胞受體的信號強度發(fā)生了改變[10-11]。因為過敏性哮喘是Th2細胞相關炎性疾病，所以Th細胞極化發(fā)育在過敏性哮喘發(fā)病機制的研究中至關重要。有關過敏性哮喘模型的研究發(fā)現(xiàn)，炎性肺組織中肥大細胞和樹突狀細胞內的miRNA-21表達過量。白細胞介素(interleukin，IL)-12 p35 3’UTR是miRNA-21靶序列中的保守序列，也是miRNA-21的作用位點，而IL-12是適應性免疫應答中Th1細胞極化的關鍵分子。另外，miRNA-21缺失的CD4+T淋巴細胞中干擾素-γ水平上升而IL- 4水平下降，猜測miRNA-21通過影響IL-12 p35的表達來調節(jié)Th1和Th2之間的平衡[12]。miRNA-126在肺組織發(fā)育過程中具有重要作用。在塵螨過敏性哮喘模型中，miRNA-126在氣道管壁細胞中依賴Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)4和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)表現(xiàn)出上調趨勢，通過miRNA拮抗劑抑制miRNA-126高表達量后可減輕哮喘癥狀，Th2細胞因子(如IL-5、IL-13)和黏液分泌量均呈減弱趨勢[12]。Let-7是首個被發(fā)現(xiàn)的人類miRNA家族成員，包含Let-7a～Let-7k。IL-13mRNA是Let-7的靶序列，在過敏性哮喘小鼠模型中，當使用抗let-7的miRNA拮抗劑作用于let-7a、let-7b、let-7c和let-7d后可減輕支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞浸潤并下調IL- 4、IL-5、IL-13的水平[13]。Kumar等[14]也發(fā)現(xiàn)，給予過敏性氣道炎性反應小鼠下調let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7f、let-7g和let-7i，可抑制IL-13分泌，從而減輕過敏性哮喘各種癥狀。因此，Let-7 miRNA在Th2炎性反應中是IL-13的一種主要調節(jié)途徑。另外，還有一些其他的miRNA也在過敏性哮喘中發(fā)揮作用，如miRNA-155可調控調節(jié)性T(regulatory T，Treg)細胞和Th17細胞分化，miRNA-146可選擇性作用于Treg細胞，從而抑制Th1反應等。

miRNA與肥大細胞

肥大細胞是IgE相關過敏性疾病的關鍵效應細胞，具有免疫調節(jié)功能。在接觸過敏原時，肥大細胞可釋放炎性調節(jié)因子，其在發(fā)育過程中也受到miRNA調控。miRNA-221和miRNA-222在肥大細胞激活后明顯上調，可通過調節(jié)細胞周期抑制劑p27(kip1)的表達抑制細胞增殖。miRNA-221和miRNA-222同時過表達會引起大量肥大細胞處于G0/G1期，少量處于G2/M期[15]。肥大細胞中miRNA-221具有肥大細胞特異性，其上調易引起脫顆粒增多、遷移減少、黏附性增加，且與細胞骨架調控和細胞因子分泌有一定聯(lián)系[16]。肥大細胞激活后，上調的miRNA-146a會增加肥大細胞凋亡；miRNA-142-3p過表達可增強FcεRI受體介導的肥大細胞脫顆粒，miRNA-142-3p有可能作為過敏性反應治療的藥物作用靶點[17]。在肥大細胞分化期間，miRNA-126通過作用于肥大細胞增殖副調控因子Spred1的基因而抑制肥大細胞增殖[18]。盡管目前發(fā)現(xiàn)許多miRNA與肥大細胞的增殖、分化和激活過程相關，但關于miRNA在肥大細胞中的功能還需進一步研究。

平滑肌細胞和上皮細胞內的miRNA

miRNA也能通過在支氣管平滑肌細胞和上皮細胞中的活動影響過敏性哮喘。平滑肌細胞是氣道高反應中主要的效應細胞，在過敏性哮喘發(fā)病機理的研究中至關重要。miRNA-133a是一種肌肉特異性miRNA，有研究報道，當受到IL-13刺激后，miRNA-133a在人氣道平滑肌細胞內水平下調，而RhoA激酶表達增多，RhoA激酶為機體內與平滑肌收縮相關的酶。miRNA-133a能顯著減弱IL-13所致GTP激酶RhoA的基因表達，合成miRNA-133a以抑制RhoA激酶基因表達，從而減輕氣道高反應性[19]。當過敏性哮喘患者的氣道平滑肌細胞受到腫瘤壞死因子-α刺激后，細胞內miRNA-140-3p表達下調，而miRNA-140-3p可通過與CD38 3′-UTR結合或間接涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核轉錄因子Kappa B活性來調節(jié)CD38的表達，而CD38是與鈣離子動員和細胞收縮相關的平滑肌細胞中的一種膜蛋白[20]。

最近研究表明，在過敏性哮喘患者和正常人體內有66種miRNA在上皮細胞中的表達量不同，通過整個分子網(wǎng)絡分析表明，這些miRNA的目標基因序列編碼疾病和炎性反應相關的蛋白，如IL-8、IL-6、環(huán)氧化酶2、腫瘤壞死因子-α和水通道蛋白- 4[21]。Let-7家族miRNA與纖維化相關，當肺上皮細胞受到塵螨抗原刺激后，會引起let-7g miRNA 驟減[22]。這些研究表明，增強促炎性通路的活性、改變緊密連接蛋白的表達或其他所觀察到的哮喘患者上皮細胞變化，這些病理特征或許部分可歸于潛在miRNA異常表達。

miRNA在過敏性哮喘診斷及治療中的應用

胞外miRNA作為診斷過敏性哮喘生物指標

miRNA在機體不同組織、細胞、發(fā)育階段甚至不同疾病狀況中表達特性各異，這一點與基因表達情況類似。最近研究表明，在血漿、血清、尿液和唾液等無細胞體液中發(fā)現(xiàn)了miRNA的存在[23]。因miRNA比mRNA和蛋白質分子更穩(wěn)定，所以有研究者提出是否可以將血清中的miRNA作為檢測疾病的生物指標；胞外miRNA是否能夠進入受體細胞并發(fā)揮作用；miRNA是否能夠用來進行細胞間交流。自2008年首次報道了胞外miRNA且指出可通過血清中miRNA-141水平來診斷前列腺癌[24]后，大量后續(xù)研究證明，miRNA可以作為癌癥、組織損傷、炎性反應，甚至特定精神疾病診斷、預后和預測的生物指標。研究表明，血清miRNA也可作為不同過敏性疾病的生物指標，在慢性阻塞性肺疾病患者的血清中發(fā)現(xiàn)，miRNA-20a、miRNA-28-3p、miRNA-34c-5p和miRNA-100顯著下調而miRNA-7上調，中度哮喘患者和正常人支氣管肺泡灌洗液中miRNA構成明顯不同[21]。哮喘是由大量不同的潛在病理生理學變化構成的復雜慢性疾病，可依據(jù)不同的臨床特征和生理變化將其分成不同類別，特異性胞外miRNA作為生物學指標以區(qū)別哮喘內在病理變化的依據(jù)是值得深入研究的方向。

miRNA在過敏性哮喘治療中的作用

目前，關于過敏性疾病的治療旨在減輕癥狀，尚不能抑制哮喘及其他過敏性疾病的發(fā)生。過敏性哮喘治療方法主要包括兩種，一是吸入性糖皮質激素，但這些抗炎藥物對于中度和重度過敏性哮喘患者效果并不明顯，該方法并不能特異性針對哮喘內在機制且易產(chǎn)生糖皮質激素抗性等不良反應；二是過敏原特異性免疫治療，方法有效但周期較長，且目前過敏原疫苗成分復雜，難以標準化[25]。抑制Th2細胞因子治療復雜多樣化的哮喘并無足夠。miRNA是機體產(chǎn)生的內源性小分子，許多組織利用其來調控基因網(wǎng)絡的表達。作用于特異性miRNA，從而通過基因表達調控治療過敏性哮喘，這或許為過敏性哮喘的治療開辟一個新的研究方向。人工合成的短雙鏈siRNA也可以發(fā)揮使基因沉默的作用，當人工siRNA導入受體細胞后，盡管靶基因序列的表達被抑制，但易造成無法預測的脫靶效應，從而引起治療的毒副作用[26]。若將外源性miRNA導入細胞，同一免疫反應通路內的若干相關基因可能都會受到影響。由于miRNA的設計保持了進化過程中的天然性，即使在治療過程中錯誤引入細胞可能也不會產(chǎn)生毒副作用。因此，miRNA可作為無毒副作用的方法來治療過敏性炎性疾病[21]。因此，可以將作用于pri-miRNA、pre-miRNA和miRNA等加工過程的小分子抑制劑作為藥物，通過調節(jié)miRNA表達來治療過敏性哮喘。然而，盡管miRNA本身無毒，但其運輸載體可能會引起不良反應，所以需要研究出更多低毒的miRNA表達調節(jié)特異性強的運送方法，這些都將為miRNA作為未來過敏性哮喘的治療手段奠定基礎。

關于miRNA用于疾病治療的研究已逐漸增多。首個miRNA靶向藥物——抗miRNA-122寡聚核苷酸已作為抗丙型肝炎病毒的藥物進入臨床實驗[27]。有研究指出，選擇性封閉miRNA-126可以抑制哮喘表型，使Th2反應、炎性反應、氣道高反應、嗜酸粒細胞聚集和黏液分泌均減弱[28]。氣道重塑是過敏性哮喘中的一大特征，miRNA-155與肺部炎性細胞浸潤和氣道重塑相關。越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)與過敏性哮喘疾病發(fā)展有關，從而使其成為最有潛力的治療手段，且基于miRNA的治療藥物已進入臨床實驗期[29]。現(xiàn)代研究技術的發(fā)展將會使得研究者更深入的了解miRNA在基因表達調控中的作用和其與哮喘發(fā)病機制間的相關性，從而利用miRNA使過敏性哮喘的治療更加個性化。

總結和展望

近幾年，我國由于污染嚴重出現(xiàn)較多霧霾天氣，且氣候變暖使花粉季節(jié)延長等，這些環(huán)境因素的改變都將使過敏性哮喘患病率和發(fā)病率增加。所以，研究過敏性哮喘發(fā)病機制、建立有效治療方法顯得十分必要和重要。miRNA在過敏性哮喘病理研究中的功能還需進一步深入，目前大部分研究集中在單個miRNA針對某個靶mRNA的作用，僅了解病變組織中某些miRNA的變化是不夠的，例如在針對Th細胞的反應中，大部分miRNA是協(xié)調發(fā)揮作用的，而某個關鍵miRNA又可影響多個靶mRNA。因此，為了更加全面理解過敏性疾病和哮喘的發(fā)病機制，應針對這些發(fā)生變化的miRNA進行系統(tǒng)研究，建立分子網(wǎng)絡。另外，miRNA出現(xiàn)在無細胞體液中，且較其他小分子穩(wěn)定，使得其具有作為過敏性哮喘診斷和預后的生物指標的潛能，通過miRNA表達調控亦可達到治療疾病的目的。隨著生物信息學、基礎免疫學、RNA生物學、基因組學、蛋白組學等不同領域發(fā)展，將會有助于了解受miRNA調節(jié)或調節(jié)miRNA的過敏性哮喘病理通路，從而使miRNA成為過敏性疾病治療的新方向。

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