夏詩琪，賴衛(wèi)華，劉道峰，崔 希

O26等產(chǎn)志賀毒素的6 種血清型大腸桿菌的暴發(fā)流行情況及檢測研究現(xiàn)狀

夏詩琪，賴衛(wèi)華*，劉道峰，崔 希

（南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

近年來，產(chǎn)志賀毒素而非O157的大腸桿菌，尤其是被美國農(nóng)業(yè)部稱為“the Big Six”的6 種大腸桿菌在諸多國家及地區(qū)暴發(fā)流行，嚴重威脅人類的健康，越來越受到世界各國的關(guān)注?！皌he Big Six”包括大腸桿菌O26、O45、O103、O111、O121、O145等6 種血清型。目前，在國內(nèi)，關(guān)于“the Big Six”的報道及研究相對較少。文中介紹“the Big Six”的暴發(fā)流行情況，并對各種檢測方法進行綜述。

產(chǎn)志賀毒素非O157大腸桿菌；暴發(fā)；檢測

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）指可產(chǎn)生志賀毒素（shiga toxin）的大腸桿菌，是重要的人畜共患病病原菌之一[1]。目前有大約250 種產(chǎn)志賀毒素大場桿菌，可將其分為O157 STEC和non-O157 STEC兩類。1983年，Riley[2]報道了首例由大腸桿菌O157∶H7引起的出血性腸炎事件，隨后加拿大、英國、意大利、日本等多個國家也相繼暴發(fā)流行。由于大腸桿菌O157∶H7致病力強，發(fā)病率高，因此受到了廣泛的關(guān)注。然而，近年來，關(guān)于non-O157 STEC，尤其是“the Big Six”暴發(fā)流行的報道逐漸增多。該大類病原菌能通過食物、人與動物接觸、人與人接觸傳播而引起人類一系列的疾病，包括水樣腹瀉、出血性腸炎、血小板減少性紫癜、溶血性尿毒綜合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）。據(jù)調(diào)查，在南半球和歐洲，non-O157 STEC對人類的危害比O157 STEC更大，尤其是O26、O103、O111、O145血清型[3]。在美國，每年由non-O157 STEC引起的食源性疾病病例高達112 752 例[4]。據(jù)統(tǒng)計，在美國由non-O157 STEC引起的患病病例中，有71%是由O26、O45、O103、O111、O121、O145血清型引起的[5]。為了保障人類的健康和牛肉市場的正常供應，2011年9月，美國農(nóng)業(yè)部頒布了一項禁止出售帶有大腸桿菌“the Big Six”（O26、O45、O103、O111、O121、O145）牛肉制品的法令[6]。

國外尤其是發(fā)達國家對大腸桿菌“the Big Six”的關(guān)注度越來越高，然而，在國內(nèi)，關(guān)于該6 種大腸桿菌的報道及研究相對較少。因此，本文就該6 種大腸桿菌的暴發(fā)流行情況和各種檢測方法進行了綜述，以期引起相關(guān)人員的重視。

1 “The Big Six”的暴發(fā)流行情況

大腸桿菌O26包括多種血清型，其中O26∶H11是臨床流行病學最重要和最主要的血清型之一[7]。關(guān)于大腸桿菌O26的報道較多。調(diào)查顯示，在德國[8]、澳大利亞[8]、加拿大[9]大腸桿菌O26是僅次于O157的第二大常見的STEC血清型。據(jù)統(tǒng)計，在美國，1983—2002年期間收集到的940 株non-O157 STEC分離株中O26血清型占22%，位居第一[10]。我國河南省于2005年首次從人體內(nèi)分離得到大腸桿菌O26∶H11[11]。

關(guān)于大腸桿菌O45的報道相對較少，但其影響力不容忽視。2001年，我國玉溪市有7 名幼兒園職工因食用被大腸桿菌O45∶H2污染的鵝肉出現(xiàn)腹瀉等癥狀[12]。2009年，法國報道發(fā)現(xiàn)了新的STEC血清型（O45∶K1），該血清型菌株是導致1/3由大腸桿菌引起的新生兒腦膜炎病患的罪魁禍首[13]。

大腸桿菌O103，包括O103∶H2、O103∶H-、O103∶H18、O103∶H21和O103∶H25血清型。1993年，Mariani-Kurkdjian等[14]從患有HUS的兒童糞便中分離得到O103∶H2血清型菌株，隨后世界各地陸續(xù)有關(guān)于O103感染病例的報道，其中挪威是大腸桿菌O103多發(fā)的國家之一，每年會暴發(fā)10～20 例人感染大腸桿菌O103的事件。2006年，挪威暴發(fā)了一場罕見的由O103∶H25血清型引起的全國性感染事件，有17 人患病，其中有10 名患上HUS[15]。

韓國是大腸桿菌O111的多發(fā)國家，調(diào)查顯示，該血清型是從感染了STEC的患者體內(nèi)最常分離得到的血清型之一，對從2002—2004年收集到的809 個糞便樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有53 個（6.55%）樣品被檢測出含有大腸桿菌O111[16]。近些年，世界各地常有關(guān)于大腸桿菌O111的報道，2008年8月，美國俄克拉荷馬州暴發(fā)了一場大規(guī)模的大腸桿菌O111感染事件，此次事件導致341 人患病[17]。

大腸桿菌O121的暴發(fā)主要在亞洲和美國。1989年，我國從一急性腹瀉患兒的膿血便中分離出國內(nèi)外首例大腸桿菌O121∶H-侵襲性菌株[18]。1999年，美國康乃迪克州暴發(fā)了由O121引起的HUS感染事件[19]，日本也于2004年報道了一起由O121引起導致63 名學生出現(xiàn)腹瀉癥狀的感染事件[20]。

大腸桿菌O 1 4 5，包括血清型O 1 4 5∶N M、O145∶H-、O145∶H8、O145∶H16、O145∶H25、O145∶H28。2005年，在斯洛文尼亞，出現(xiàn)了一例因食用被O145感染的牛肉糜患上HUS并最終導致死亡的病例[21]。2007年9月，比利時暴發(fā)了由O145和O26引起的感染事件，5 人患有HUS，7 人出現(xiàn)血性腹瀉[22]。2010年，美國報道了一起由O145引起的感染事件。此次暴發(fā)涉及面廣，影響范圍包括密歇根州、紐約州、田納西州在內(nèi)的多個地區(qū)，共有11 人住院，3 人患上HUS[23]。

2 檢測方法

2.1 平板培養(yǎng)法

顯色培養(yǎng)基是一類利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應顯色底物反應顯色的原理來檢測微生物的新型培養(yǎng)基。利用顯色培養(yǎng)基進行微生物的篩選分離，其反應的靈敏度和特異性大大優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)基。

美國農(nóng)業(yè)部采用了一種基于顯色瓊脂培養(yǎng)基同時檢測牛肉中“the Big Six”的方法[6]。該培養(yǎng)基基于糖類的發(fā)酵，β-半乳糖苷酶的活性和對選擇性試劑的抗性，通過菌落顏色來判斷所屬的血清型。該方法的回收率為54.2%～97.9%，O26的回收率最高。顯色培養(yǎng)基提供了一種能夠有效檢測食品中“the Big Six”的方法。

2.2 免疫學檢測方法

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA）

ELISA是以酶標記抗原或酶標記抗體為主要試劑，通過復合物中的酶催化底物顯色而對被測物進行定性或定量分析的免疫技術(shù)。由于該技術(shù)是建立在抗原抗體反應和酶的高效催化作用的基礎上，故其具有檢測靈敏度高、特異性強、準確性好的特點。

Hegde等[24]利用雙抗體夾心ELISA檢測牛肉糜樣品中的6 種非O157大腸桿菌，結(jié)果顯示O103、O111、O121的特異性為100%，O26、O45的特異性為98.2%，O145的特異性為99.1%，檢測限為5×105CFU/mL。Neely等[25]利用單克隆抗體（MAb 2F3）設計雙抗體夾心ELISA實驗，檢測限是103CFU/mL，該實驗提供了一種可靠的從混合菌中檢測O26的方法。

2.2.2 免疫磁珠分離技術(shù)（immunomagnetic beads separation techniques，IMS）

IMS是將免疫學反應的高度特異性與磁珠特有的磁響應性相結(jié)合的一種新的免疫學技術(shù)。該技術(shù)利用經(jīng)化學修飾的磁性微粒包被特異性抗體，在外部磁力的作用下從樣品中分離富集靶細菌。

Jenkins等[26]用多克隆抗體包被磁珠，從牛糞便樣品中富集待檢菌，結(jié)果顯示，利用IMS玻片凝集反應（IMS-slide agglutination tests，IMS-SA）檢測大腸桿菌O26的靈敏度是PCR/DNA探針技術(shù)的2.5 倍。IMS常與其他技術(shù)聯(lián)用，例如與ELISA聯(lián)用能檢測較低濃度的菌液，同時能縮短前增菌時間，并且提高ELISA的靈敏度。Urdahl等[27]研究表示，對于大腸桿菌O103的檢測，自動化的IMS-ELISA能檢測出52.1%的陽性樣本，比自動化的IMS凝集反應（36.5%）高。

2.2.3 膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal glod immunochromatographic assay，GICA）

GICA是一種以膠體金為示蹤標記物，基于抗原抗體反應的免疫標記技術(shù)。該方法快速便捷，操作簡單，不需要特殊設備就能得到直觀的結(jié)果，適用于現(xiàn)場大量樣品的快速篩查。

Yonekita等[28]用膠體金免疫層析技術(shù)同時檢測大腸桿菌O157、O26、O111。將大腸桿菌O157、O26、O111多克隆抗體分別噴在硝酸纖維素膜上作為檢測線，控制線上噴有抗鏈霉親和素抗體，制備成試紙條。檢測時將試紙條的樣本墊插入由被生物素標記的抗菌肽、鏈霉親和素膠體金和待檢菌液混合而成的待檢樣品中，反應15 min后若檢測線和控制線均為紫紅色則表示結(jié)果為陽性。該方法的檢測限為104CFU/mL，特異性高，無交叉反應。

2.2.4 乳膠凝集實驗（latex agglutination assays，LTA）

LTA是一種將抗原（抗體）吸附于聚苯乙烯乳膠微粒表面，然后與相應抗體（抗原）作用，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下發(fā)生的凝集反應。

Medina等[29]利用IgG與乳膠微粒共價結(jié)合形成的復合物檢測大腸桿菌“the Big Six”，大量的重復實驗證明該方法可行有效、省時。實驗所用試劑制備簡單、花費低，在4 ℃條件下能夠保存1 年以上，并且能夠特異性識別目標菌。

2.3 分子生物學檢測方法

2.3.1 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）

PCR是1983年建立的分子生物學經(jīng)典實驗方法，用于擴增特定的DNA片段。近些年，在常規(guī)PCR的基礎上，研究人員嘗試用新型的PCR方法對大腸桿菌“the Big Six”進行檢測，取得了良好的效果。多重PCR（multiplex PCR，mPCR）是在常規(guī)PCR的基礎上發(fā)展起來的一種新的PCR擴增技術(shù)。相比之下，mPCR的優(yōu)勢在于能在同一反應體系中加入多對引物，同時對多個目的基因進行擴增，從而同時檢測出多種病原微生物。實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）通過在反應體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號實時監(jiān)控目標序列的擴增情況，最后用標準曲線進行定量分析。與常規(guī)PCR相比，qPCR的優(yōu)點在于能夠定量分析，此外，qPCR還具有省時、效率高的特點。

表1 一些PCR技術(shù)對大腸桿菌“the Big Six”檢測的比較Table 1 Comparison of different PCR methods for the detection of“the Big Six”

新型PCR技術(shù)能夠彌補常規(guī)PCR的缺陷，在微生物檢測領域有較好的應用前景。表1列舉了一些PCR技術(shù)對大腸桿菌“the Big Six”檢測的比較。

2.3.2 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP是一種新型的恒溫核酸擴增方法。該方法與熒光定量PCR相比，不需要模板的熱變性、長時間的熱度循環(huán)、繁瑣的電泳和紫外觀察等過程，并且同樣具有檢測速度快、特異性高、靈敏度高、能定量測定的特點，應用前景十分廣闊。

Wang Fei等[36]針對wzx、wzy基因建立LAMP實驗，對大腸桿菌“the Big Six”和O1577種血清型進行檢測。細菌純培養(yǎng)中檢測限為1～20 CFU/25 μL，食品樣品中的檢測限為103～104CFU/g。Hara-Kudo等[37]研究發(fā)現(xiàn)用LAMP檢測O26的靈敏度（1.000）優(yōu)于IMS平板培養(yǎng)法（0.803）。

2.3.3 流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）

FCM是一種利用流式細胞儀測量液相中懸浮細胞或微粒的現(xiàn)代化高新定量分析技術(shù)。FCM主要的儀器為流式細胞儀，其工作原理是將待測細胞或微粒經(jīng)熒光染色制成懸浮樣本后，單個依次通過檢測區(qū)域，經(jīng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號，通過對熒光信號進行分析處理最后得到數(shù)字信號。流式細胞技術(shù)在食品安全，公共健康，臨床診斷和環(huán)境監(jiān)控等方面的快速檢測領域有很廣闊的前景。

Hegde等[38]利用流式細胞術(shù)對牛肉糜中的大腸桿菌“the Big Six”進行快速檢測。該實驗無交叉反應，檢測速度快，靈敏度高（在105CFU/mL的混合菌中，有2×103個目標菌即可檢出），特異性高，并且能同時進行多參數(shù)檢測。

2.3.4 多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析（multiple locus variable numbers tandem repeat analysis，MLVA）

以PCR技術(shù)為基礎的MLVA是一種新型的用于大規(guī)模菌株基因型鑒定的方法，該方法以可變數(shù)目串聯(lián)重復序列重復單元拷貝數(shù)的差異為依據(jù)，操作簡單，分辨能力強，重復性和穩(wěn)定性好，能提供數(shù)字化的分型信息，適宜進行大量樣本和網(wǎng)絡化分析。

Miko等[39]利用MLVA技術(shù)和脈沖場凝膠電泳技術(shù)（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）對從人類、動物、食物中分離出的62 株大腸桿菌O26分型。結(jié)果表明，MLVA比PFGE更快速、花費低，能為流行病學的調(diào)查提供依據(jù)。

2.3.5 生物傳感器

生物傳感器是一種利用生物材料（核酸等）的識別作用將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號進行檢測的新興技術(shù)。該方法與ELISA、PCR等相比具有快速、特異性高、靈敏度高等特點。生物傳感器能夠成為一個在臨床診斷、食品安全、生物威脅檢測和環(huán)境監(jiān)控等領域篩查病原微生物的有效工具。

Luo Caihui等[40]基于目標物誘導適配體位移設計了電化學生物傳感器來檢測大腸桿菌O111。實驗表明，該技術(shù)靈敏度高，理想條件下在磷酸鹽緩沖液中的檢測限為112 CFU/mL，牛奶中的檢測限為305 CFU/mL。同時也具有較高的特異性，并且能在3.5 h內(nèi)完成對大腸桿菌O111的整個分析過程。

2.3.6 PFGE

PFGE是一種基于瓊脂糖凝膠電泳，通過外部電場的不斷變化，使DNA分子的泳動隨之變化，最后在凝膠上呈現(xiàn)出電泳條帶的方法。該技術(shù)與普通瓊脂糖凝膠電泳相比，能夠分離50 kb以上的大分子DNA，重復性好、分辨力強，是細菌生物學分型技術(shù)的金標準。

Sekse等[41]利用PFGE鑒定大腸桿菌O26∶H11分離株的基因關(guān)系，與MLVA比較，PFGE的識別能力更強。

3 結(jié) 語

大腸桿菌O26、O45、O103、O111、O121、O145的暴發(fā)具有全球性，并且能夠引起人類多種疾病，對人類的健康具有重大的危害。世界各國對大腸桿菌“the Big Six”的關(guān)注度越來越高，目前，發(fā)達國家對該6 種大腸桿菌血清型的檢測方法報道較多，包括免疫學方法和分子生物學方法等。然而，國內(nèi)的研究機構(gòu)和科研工作者對這方面的研究相對較少。本文對該6 種大腸桿菌血清型的暴發(fā)情況和檢測方法做了較詳細的闡述，希望能為相關(guān)工作提供參考依據(jù)。在已報道的檢測方法中，聚合酶鏈式反應等分子生物學方法雖然具有快速、特異性高、靈敏等特點，但是對操作人員的技術(shù)水平要求較高，僅適用于高級、專業(yè)部門使用。在分子生物學方法的應用中，如果能夠解決區(qū)分死活細胞這一難題，其應用范圍將會更廣泛?；诿庖邔W的快速檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附實驗、免疫磁珠分離技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)等在解決實際問題的過程中不僅具有快速、靈敏的優(yōu)勢，而且還能做成非專業(yè)人員也能使用的便攜試劑盒，實現(xiàn)在線檢測，應用范圍廣。免疫學方法中的免疫磁珠分離技術(shù)常應用于酶聯(lián)免疫吸附實驗和膠體金免疫層析技術(shù)中，達到縮短實驗時間的目的；今后，酶聯(lián)免疫吸附實驗和膠體金免疫層析技術(shù)如果在提高特異性和靈敏度的同時考慮向定量、半定量檢測和多元檢測方向發(fā)展，該方法的應用將會更廣泛。

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Outbreaks and Detection Methods of Six Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Serogroups Including O26: Current Situation

XIA Shi-qi, LAI Wei-hua*, LIU Dao-feng, CUI Xi
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Recently, non-O157 shiga toxin-producing Escherichia coli, especially the top six non-O157 shiga toxinproducing Escherichia coli serogroups that are named as “the Big Six” by the United States Department of Agriculture, have been responsible for numerous outbreaks worldwide. These non-O157 STEC pose a severe threat to human health and therefore has gained increasing global attention. “the Big Six” include E. coli O26, O45, O103, O111, O121 and O145 serogroups. Nowadays, little research has been reported on “the Big Six” in China. This article reviews recent outbreaks of “the Big Six” and various methods applied to detect these pathogens.

non-O157 shiga toxin-producing Escherichia coli; outbreaks; detection methods

TS207.3

A

1002-6630（2014）17-0301-05

10.7506/spkx1002-6630-201417057

2013-11-27

科技部食品科學與技術(shù)國家重點實驗室自由探索課題（SKLF-ZZB-201307）；南昌市科學技術(shù)局黨外專家博士產(chǎn)學研合作專項（2012-CYH-DW-SP-001）

夏詩琪（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：496508689@qq.com

*通信作者：賴衛(wèi)華（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：talktolaiwh@163.com