閆穎娟，盧 儉，周劍忠，李 偉，董明盛,*

基于響應曲面法的微囊化保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

閆穎娟1,2，盧 儉1,3，周劍忠4，李 偉2，董明盛2,*

（1.忻州師范學院生物系，山西 忻州 034000；2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；3.南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司，江蘇 南京 211100；4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

采用響應曲面法對微囊化保加利亞乳桿菌FMG-4高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明：最佳培養(yǎng)基配方為：在MRS培養(yǎng)基中添加乳清粉97.15 g/L、大豆蛋白粉10.00 g/L、酵母粉7.55 g/L、碳酸鈣8.03 g/L、硫酸鎂0.30 g/L、硫酸錳0.02 g/L。最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度41.7 ℃、初始pH 6.9。此時保加利亞乳桿菌FMG-4細胞菌密度可達到3.18×1011CFU/g。

液芯微囊；響應曲面法；保加利亞乳桿菌；高密培養(yǎng)

酸奶發(fā)酵劑應具有較高的活力和穩(wěn)定性。對篩選出來的乳酸菌進行高活性、高密度培養(yǎng)（high cell density culture，HCDC）是制備高效乳酸菌酸奶發(fā)酵劑的關(guān)鍵。目前我國大多數(shù)大型乳品加工企業(yè)采用國外進口的直投式酸奶發(fā)酵劑，其質(zhì)量穩(wěn)定、生產(chǎn)易行，菌體密度可達到1011CFU/g，但價格昂貴，生產(chǎn)成本大[1-3]。液芯微囊發(fā)酵劑是采用生物微囊化技術(shù)將發(fā)酵菌株包裹在球狀微囊內(nèi)，通過連續(xù)培養(yǎng)制備的微囊化發(fā)酵劑。從培養(yǎng)基中分離這種發(fā)酵劑無需經(jīng)過超濾或冷凍離心，普通離心或微過濾即可進行，因此大大降低了生產(chǎn)成本，更重要的是可以減輕離心對菌體的傷害。另外，乳酸菌細胞包囊后還可以防止氧對菌體的損傷以及噬菌體感染，對乳酸菌細胞起到保護的作用[4-6]。

將微囊化的酸奶發(fā)酵劑進行高密度培養(yǎng)，是其能夠應用于實際生產(chǎn)的關(guān)鍵。高密度培養(yǎng)是指在液體增菌培養(yǎng)液中，微生物細胞密度超過正常培養(yǎng)一個數(shù)量級以上，也被稱為高密度發(fā)酵技術(shù)。HCDC技術(shù)廣泛地應用于發(fā)酵工業(yè)中，通過這種培養(yǎng)方式可以降低設(shè)備投資，縮短生產(chǎn)周期，從而降低生產(chǎn)成本，提高商品化發(fā)酵劑的市場競爭力[7-9]。液芯微囊發(fā)酵劑的HCDC研究將為微囊化乳酸菌發(fā)酵劑的實際生產(chǎn)提供理論指導和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）FMG-4：本實驗室保藏。

MRS培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀2.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、無水乙酸鈉5.0 g、硫酸錳0.25 g、蛋白胨10.0 g、酵母浸膏5.0 g、牛肉浸膏10.0 g、葡萄糖20.0 g、硫酸鎂0.58 g、吐溫-80 1.0 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 6.8～7.0，121 ℃滅菌20 min。

海藻酸鈉 ISP美國國際特品公司；脫脂奶粉、低蛋白乳清粉（乳糖含量80%，蛋白質(zhì)含量3%） 新西蘭紐迪希亞公司；大豆蛋白粉（蛋白質(zhì)含量60%） 鎮(zhèn)江市尚谷食品有限公司；黃原膠、殼聚糖、蔗糖（食品級） 上海萬疆生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

自制液芯微囊化細胞無菌制備裝置；HG303-4A型電熱干燥培養(yǎng)箱 南京實驗儀器廠；LRH-150型生化培養(yǎng)箱 上海益恒實驗儀器有限公司；THZ-D臺式恒溫振蕩器 太倉市實驗設(shè)備廠；XW-80型旋渦混合器 上海醫(yī)科大學儀器廠；S-3000N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 上海科析試驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 液芯微囊的制備

將甘油管保存的保加利亞乳桿菌FMG-4用MRS液體培養(yǎng)基活化2 次，發(fā)酵液離心收集菌體，加入少許生理鹽水懸浮菌泥，再將其倒入質(zhì)量濃度為15 g/L的氯化鈣溶液和質(zhì)量濃度為3 g/L的黃原膠溶液的混合液中制成菌懸液。采用自制液芯微囊無菌制備裝置，將上述菌懸液逐滴滴入磁力攪拌的質(zhì)量濃度為8.8 g/L的海藻酸鈉溶液中反應一段時間，然后用適量的蒸餾水稀釋海藻酸鈉溶液。從稀釋液中過濾出海藻酸鈣液芯微囊，將獲得的海藻酸鈣液芯微囊洗滌后，轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為10 g/L的氯化鈣溶液中進行20 min硬化處理，之后用蒸餾水洗掉其表面殘留的氯化鈣，然后將微囊放入預配好的質(zhì)量濃度為3 g/L的殼聚糖溶液中浸泡。浸泡一定時間后濾出微囊，再次使用蒸餾水進行沖洗，最后將制得的海藻酸鈣液芯微囊成品保存在配制好的生理鹽水中。圖1為液芯微囊的制備過程[10-12]。

圖1 微囊制備流程Fig.1 Flow chart of liquid-core microcapsule preparation

1.3.2 微囊化酸奶發(fā)酵乳酸菌的高密度培養(yǎng)

將制備好的包裹有保加利亞乳桿菌的液芯微囊，按照5%的接種量加入到預配好的MRS液體增菌培養(yǎng)基中，在40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，之后將液體增菌培養(yǎng)基更換，采用同樣的方法連續(xù)培養(yǎng)5個批次。培養(yǎng)結(jié)束后，將液芯微囊濾出，殘留液芯微囊外的菌體采用無菌水進行洗滌，然后采取化學破囊法將液芯微囊破碎釋放，最后通過平板計數(shù)法測試每克液芯微囊內(nèi)的菌體數(shù)量。

1.3.3 響應曲面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

1.3.3.1 響應曲面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

使用Design Expert軟件，以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用部分重復因子設(shè)計方法[13-15]和最陡爬坡試驗，研究乳清粉、大豆蛋白粉、酵母粉、碳酸鈣、硫酸鎂、硫酸錳等組分添加量對微囊化乳酸菌高密度培養(yǎng)的影響。從中篩選出顯著影響組分因子，通過響應曲面設(shè)計建立細胞密度的模型方程。

1.3.3.2 響應曲面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

采用使用Design Expert軟件，對培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度和初始pH值）進行優(yōu)化，建立細胞密度的模型方程[16]。

1.3.4 高密度培養(yǎng)后微囊內(nèi)外菌體掃描電鏡觀察

將高密度培養(yǎng)后微囊，置于2.5%的戊二醛溶液中固定12 h，用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每次10 min，再分別用50%、70%、90%的乙醇梯度脫水15 min，然后用100%乙醇脫水3 次，每次30 min。用叔丁醇置換3次，每次30 min。將樣品放入臨界點干燥儀中用液態(tài)二氧化碳進行臨界點干燥，用雙面膠帶將樣品黏到樣品臺上，用離子濺射儀給樣品鍍上10 nm金膜，最后用S-3000N型掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 微囊化保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 部分重復因子設(shè)計法篩選關(guān)鍵因子

通過Design Expert軟件，對乳清粉（X1）、大豆蛋白粉（X2）、酵母粉（X3）、碳酸鈣（X4）、硫酸鎂（X5）、硫酸錳（X6）等關(guān)鍵因子進行篩選，其試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。通過對試驗數(shù)據(jù)進行逐步回歸分析，得到保加利亞乳桿菌細胞密度（Y）的回歸方程為：Y = 10.52+0.25X1-0.035X2+0.14 X3+0.15 X4-0.007 5 X5+0.010X6。

表1 部分重復因子設(shè)計方案及結(jié)果Table 1 Experimental design and results of fractional factorial design (FFD)

表2 保加利亞乳桿菌細胞密度回歸方程方差分析Table 2 ANOVA for the regression equation of L. bulgaricus counts

表3 保加利亞乳桿菌細胞密度回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗Table 3 Regression coefficients and their significance for L. bulgaricus counts

對該回歸方程進行方差分析（表2），該模型具有極顯著性水平足夠擬合試驗數(shù)據(jù)。由回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗（表3）可知，培養(yǎng)基中乳清粉、酵母粉和碳酸鈣添加量是極顯著影響因素（P＜0.01），乳清粉、酵母粉、碳酸鈣添加量對乳酸菌細胞密度具有顯著正相關(guān)效應，大豆蛋白粉添加量與乳酸菌細胞密度呈負相關(guān)效應，而硫酸鎂、硫酸錳添加量與乳酸菌細胞密度無相關(guān)性，期望值變化較小，因此從經(jīng)濟性角度考慮，取硫酸鎂、硫酸錳的最小值，分別為0.3、0.02 g/L。

2.1.2 最陡爬坡試驗

由于大豆蛋白粉、硫酸鎂、硫酸錳添加量對乳酸菌細胞密度影響不顯著，而乳清粉、酵母粉、碳酸鈣添加量3 個因素與乳酸菌細胞密度呈顯著正相關(guān)，因此保持前者3 組值不變，根據(jù)乳清粉、酵母粉、碳酸鈣添加量3個因素回歸方程系數(shù)的比例關(guān)系，設(shè)定步長進行試驗，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表4。試驗組4對應的乳酸菌細胞密度最大，為1.38×1011CFU/g，因此將試驗組4選作后續(xù)試驗的中心點。

表4 最陡爬坡試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 4 Steepest ascent experimental design and results

2.1.3 響應曲面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

表5 培養(yǎng)基優(yōu)化中心組合設(shè)計方案及結(jié)果Table 5 Central composite design with experimental and predicted results of L. bulgaricus counts for optimization of medium components

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，以試驗組4為中心點進行中心組合試驗，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表5。以乳清粉（A）、酵母粉（B）、碳酸鈣（C）添加量為自變量，以細胞密度（Y）為因變量對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到二次多項式方程為：Y = 11.24+ 0.13A+0.15B+0.087C-0.33A2-0.16B2-0.16C2-0.070AB+0.018AC-0.012BC。對模型進行方差分析（表6）可知，模型具有極顯著性（P＜0.001），判定系數(shù)R2= 0.967 2，即該模型可以解釋96.72%乳酸菌細胞密度的變化，失擬項不顯著（P＞0.05），表明該模型方程對數(shù)據(jù)擬合情況較好。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗（表7）可知，3 個主效應因素均為顯著影響因素（P＜0.05）。

表6 保加利亞乳桿菌細胞密度二次多項模型方差分析Table 6 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model for L. bulgaricus counts

表7 保加利亞乳桿菌細胞密度模型方程系數(shù)顯著性檢驗Table 7 Regression coefficients and their significance for L. bulgaricus counts

響應曲面和等高線圖見圖2～4，由圖2可知，乳清粉和碳酸鈣的交互作用對細胞密度的影響不顯著，當乳清粉添加量小于95 g/L時，乳酸菌細胞密度隨著其添加量的增加呈快速上升的趨勢；當大于95 g/L時，細胞密度反而呈下降趨勢。碳酸鈣的變化對細胞密度的影響比乳清粉小，當碳酸鈣添加量小于7.9 g/L時，隨著碳酸鈣添加量的增加，細胞密度略有增加，而當碳酸鈣添加量大于7.9 g/L時，細胞密度隨其添加量的增加而減少，這可能是因為培養(yǎng)基中添加適量碳酸鈣可以起到增加液芯微囊的機械強度、緩沖環(huán)境pH值的作用，為酸奶發(fā)酵乳酸菌提供良好的生長環(huán)境，但過量時反而不利于乳酸菌細胞的生長[17-19]。圖3與圖4變化趨勢相同，酵母粉和乳清粉、碳酸鈣添加量的交互作用對細胞密度的影響均顯著，當酵母粉添加量小于7.2 g/L時，隨著酵母粉添加量的增加，細胞密度呈增加趨勢且增幅較大，而當酵母粉添加量大于7.2 g/L時，變化趨于平緩。

圖2 乳清粉和碳酸鈣添加量及其交互作用對保加利亞乳桿菌細胞密度影響的響應面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the interactive effect of whey power and CaCO3concentration on L. bulgaricus counts

圖3 乳清粉和酵母粉添加量及其交互作用對保加利亞乳桿菌細胞密度影響的響應面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the interactive effect of whey power and yeast powder concentration on L. bulgaricus counts

圖4 酵母粉和碳酸鈣添加量及其交互作用對保加利亞乳桿菌細胞密度影響的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effect of yeast powder and CaCO3concentration on L. bulgaricus counts

將乳清粉、酵母粉、碳酸鈣的添加量取值范圍分別設(shè)定在90～110、6～8、6.7～8.7 g/L，并將細胞密度設(shè)定為目標最大值，根據(jù)軟件給出的10 組最優(yōu)組合（表8），從經(jīng)濟角度考慮，選取第4組的組合，即培養(yǎng)基配方為：乳清粉97.15 g/L、大豆蛋白粉10 g/L、酵母粉7.55 g/L、碳酸鈣8.03 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、硫酸錳0.02 g/L。

表8 培養(yǎng)基優(yōu)化的10 組最優(yōu)組合Table 8 Optimal medium formulations

2.2 響應曲面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

表9是利用中心組合試驗對溫度和初始pH值進行優(yōu)化的設(shè)計方案及結(jié)果。對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得到乳酸菌細胞密度預測值（Y）對自變量培養(yǎng)溫度（A）和初始pH值（B）的多元回歸方程為Y = 10.98-0.20A-0.01B-0.35 A2-0.46B2+0.035AB。

表9 培養(yǎng)條件的中心組合設(shè)計及試驗結(jié)果Table 9 Central composite design with experimental and predicted results of L. bulgaricus counts for optimization of culture conditions

對該模型方程進行方差分析（表10），結(jié)果表明該模型極顯著（P＜0.01），R2= 0.993 7，表明該模型能解釋99.37%細胞密度的變化，失擬項不顯著（P＞0.05），說明細胞密度的實測值和預測值之間擬合度較好，因此該方程作為酸奶發(fā)酵乳酸菌的細胞密度模型是合適的。

表10 細胞密度二次多項模型方差分析Table 10 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model for L. bulgaricus counts

表11 細胞密度模型方程系數(shù)顯著性檢驗Table 11 Regression coefficients and their significance for L. bulgaricus counts

由方程系數(shù)及其顯著性檢驗結(jié)果可知（表11），初始pH值對細胞密度影響不顯著，而溫度對其影響顯著。由響應曲面及等高線（圖5）可知，當培養(yǎng)溫度在40～42 ℃時，細胞密度隨著培養(yǎng)溫度的升高而增加，當溫度大于42 ℃時細胞密度出現(xiàn)負增長；從等高線圖可以看出，培養(yǎng)溫度和初始pH值的交互作用不顯著。

圖5 培養(yǎng)溫度和初始pH值及其交互作用影響保加利亞乳桿菌細胞密度的響應曲面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the interactive effect of culture temperature and pH on L. bulgaricus counts

將培養(yǎng)溫度和初始pH值分別設(shè)定在40～44 ℃和6.6～7.2，用乳酸菌細胞密度作為靶向最大值，通過實驗軟件進行優(yōu)化處理，得到的10 組最優(yōu)組合培養(yǎng)條件見表12，根據(jù)實驗結(jié)果，微囊化保加利亞乳桿菌最優(yōu)的培養(yǎng)條件選擇第6組，即培養(yǎng)溫度為41.7 ℃，初始pH值為6.9。

表12 培養(yǎng)條件的10 組最優(yōu)組合Table 12 Optimal combinations of culture conditions

2.3 微囊化酸奶發(fā)酵乳酸菌高密度培養(yǎng)

用優(yōu)化的培養(yǎng)基在41.7 ℃、初始pH 6.9條件下對游離乳酸菌和微囊化乳酸菌分別進行連續(xù)5 批增殖培養(yǎng)，結(jié)果見圖6。微囊內(nèi)乳酸菌細胞密度在第1批和第2批的增殖培養(yǎng)過程中極顯著增加（P＜0.01），第3批發(fā)酵結(jié)束時達到3.18×1011CFU/g，之后液芯微囊內(nèi)細胞密度變化不顯著（P＞0.05），而游離條件下乳酸菌細胞密度在所有培養(yǎng)批次中變化均不顯著（P＞0.05）。

圖6 微囊化酸奶發(fā)酵乳酸菌連續(xù)培養(yǎng)過程中囊內(nèi)細胞密度的變化Fig.6 Change in L. bulgaricus counts in liquid-core capsules during continuous culture

2.4 高密度培養(yǎng)后微囊內(nèi)外菌體掃描電鏡

圖7 液芯微囊內(nèi)（A）和外（B）菌體掃描電鏡圖（×1 000）Fig.7 SEM images (× 1 000) of high-density cultured cells inside (A) and outside (B) liquid-core microcapsules

由圖7可知，囊內(nèi)保加利亞乳桿菌菌體粗壯，形態(tài)良好，菌體分布均勻，密度較高，而囊外表面菌體密度較少，說明液芯微包囊可以對菌體起到較好的保護作用。

3 結(jié) 論

隨著商品發(fā)酵劑應用的迅速增加，發(fā)酵劑的經(jīng)濟性成為一個重要研究指標，為了實現(xiàn)這個目標，在實踐中需要針對每個特定過程建立相應的高效發(fā)酵模式。因此，大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)和工藝在工業(yè)化實踐中就顯得日趨重要。高密度培養(yǎng)技術(shù)不僅是生產(chǎn)高質(zhì)量濃縮型菌體和代謝產(chǎn)物的重要環(huán)節(jié)，也是能否以低成本實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵性因素[20-21]。

微生物培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件在HCDC培養(yǎng)過程中占有極其重要的地位。本實驗采用響應曲面設(shè)計優(yōu)化了用于微囊化保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方：以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加乳清粉97.15 g/L、大豆蛋白粉10.00 g/L、酵母粉7.55 g/L、碳酸鈣8.03 g/L、硫酸鎂0.30 g/L、硫酸錳0.02 g/L。高密度培養(yǎng)微囊化保加利亞乳桿菌的最優(yōu)條件為：培養(yǎng)溫度41.7 ℃、初始pH 6.9。此時保加利亞乳桿菌FMG-4細胞菌密度可達到3.18×1011CFU/g。

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Optimization of High Cell Density Culture Conditions for Microencapsulated Lactobacillus bulgaricus by Response Surface Methodology

YAN Ying-juan1,2, LU Jian1,3, ZHOU Jian-zhong4, LI Wei2, DONG Ming-sheng2,*
(1. Department of Biology, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. Nanjing Weigang Dairy Co. Ltd., Nanjing 211100, China; 4. Institute Agro-product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

In this study, the medium composition and culture conditions for microencapsulated Lactobacillus bulgaricus FMG-4 were optimized using response surface methodology. The results showed that the optimal medium for high cell density culture of microencapsulated Lactobacillus bulgaricus FMG-4 was an MRS medium supplemented with 97.15 g/L whey powder, 10.00 g/L soy protein powder, 7.55 g/L yeast powder, 8.03 g/L calcium carbonate, 0.30 g/L magnesium sulfate and 0.02 g/L manganese sulfate. The optimal culture conditions were 41.7 ℃ and an initial pH of 6.9. Under the optimized culture conditions, the density of L. bulgaricus FMG-4 reached 3.18×1011CFU/g.

liquid core microcapsule; response surface methodology; Lactobacillus bulgaricus; high cell density culture

TS201.3

A

1002-6630（2014）17-0153-07

10.7506/spkx1002-6630-201417030

2014-01-08

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B01-4）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100903）；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金項目（KYZ201419）；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2012GB23600639）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目

閆穎娟（1985—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：sxxzyyj@163.com

*通信作者：董明盛（1961—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：dongms@njau.edu.cn