馬延龍，周如金,*，曾興業(yè)，邱松山，聶麗君

含羥基苯甲酸甲酯的順、反丁烯二酸酯類化合物的合成及抑菌活性

馬延龍1,2，周如金1,2,*，曾興業(yè)2，邱松山2，聶麗君2

（1.江蘇科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212003；2.廣東石油化工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，廣東 茂名 525000）

以順、反丁烯二酸單酯和o,m,p-羥基苯甲酸甲酯為起始原料合成了6 種新型的含羥基苯甲酸甲酯單元的順、反丁烯二酸酯類化合物，目的在于發(fā)現(xiàn)新的具有抑制食品相關(guān)細(xì)菌和真菌生長能力的生物活性分子。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography mass spectrometer，LC-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）表征和元素分析。體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有合成的化合物對(duì)8 種供試菌有著較好的抑菌效果，化合物4a的抑菌活性最強(qiáng)（最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≤75 μg/mL），化合物4a對(duì)釀酒酵母、黃曲霉和產(chǎn)黃青霉的MIC分別為25、37.5、37.5 μg/mL。

順、反丁烯二酸酯類化合物；合成；抑菌活性

α,β-不飽和羰基化合物是化學(xué)工業(yè)中重要的有機(jī)物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于合成化學(xué)品、藥物、溶劑、食品添加劑和消毒劑。由于α與β的碳碳雙鍵和羰基碳氧雙鍵之間具有共軛作用，導(dǎo)致β-碳具有部分正電荷，致使親核基團(tuán)更容易進(jìn)攻β-碳，因此能與含有富電子基團(tuán)的生物大分子多肽、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生Michael加成反應(yīng)[1-5]，使生物大分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以致擾亂其生物活性。富馬酸酯類化合物就屬于這一類化合物且具有較強(qiáng)的生物活性[6-8]，通常作為食品添加劑用于食品行業(yè)或作為臨床藥物用于治療牛皮癬和多發(fā)性硬化癥[9-10]。但是富馬酸酯類化合物對(duì)人體有一定的刺激反應(yīng)[11]，限制了其應(yīng)用。為了克服此缺點(diǎn)并保留其活性中心——α,β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)，國內(nèi)研究者主要以順、反丁烯二酸為母體結(jié)構(gòu)，一端引入甲酯，另一端引入海藻糖、甘油、VC、苯環(huán)、長鏈烷烴等取代基[12-17]，以降低刺激反應(yīng)。

羥基苯甲酸酯類化合物在食品和藥物行業(yè)中也具有重要的作用，其中對(duì)羥基苯甲酸甲酯被公認(rèn)為是相對(duì)安全的化學(xué)品，具有低成本、低毒性和抗菌譜廣等特性，因而被廣泛應(yīng)用于化妝品和食品行業(yè)[18-19]。因此將順、反丁烯二酸單酯類化合物和羥基苯甲酸酯類化合物結(jié)合，合成新的α,β-不飽和羰基化合物，不僅可以降低富馬酸酯類化合物對(duì)人體的負(fù)面影響，而且還可以增強(qiáng)其抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

豬霍亂沙門氏菌豬霍亂亞種（S. choleraesuis subsp. choleraesuis ATCC 13312）、乳酸鏈球菌乳亞種（L. lactis subsp. lactis ATCC 11454）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis ATCC 6633）、白假絲酵母菌（C. albicans ATCC 10231）、釀酒酵母（S. cerevisiae ATCC 9763）、黃曲霉（A. flavus CICC 40191）、黑曲霉（A. niger CICC 2273）、產(chǎn)黃青霉（P. chrysogenum CICC 4017），由廣東石油化工學(xué)院食品系提供。

細(xì)菌NB培養(yǎng)基：葡萄糖1%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%，pH 7.0～7.2。真菌SDA固體培養(yǎng)基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、瓊脂2%，pH值自然。真菌SDB液體培養(yǎng)基無瓊脂。

所用試劑均為市售化學(xué)純，無水四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）由金屬鈉蒸餾制備。

1.2 儀器與設(shè)備

DSC-500BL差示掃描量熱儀 上海盈諾精密儀器有限公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）（SPD-20A，LC-20AT）、LC/MS-2020型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatography mass spectrometer，LC-MS）（ESI離子源） 日本島津公司；AVANCEⅡ400核磁共振儀（nuclear magnetic resonance，NMR）（二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）-d6（δH=2.51, δC=39.5, δH=3.34, H2O）為溶劑，四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS）為內(nèi)標(biāo)） 瑞士Bruker公司；Vario EL CUBE 元素分析儀 德國Elmentar公司。

1.3 方法

1.3.1 表征方法

HPLC測(cè)試方法：流速為1 mL/min，檢測(cè)波長為254 nm，流動(dòng)相為CH3OH-H2O（水中含有0.5%的甲酸）= 80∶20（V/V），進(jìn)樣量為10 μL。LC-MS測(cè)試方法：流速為1 mL/min，檢測(cè)波長為254 nm，流動(dòng)相為A：0.1% HCOOH-H2O，B：0.1% HCOOH-CH3CN，梯度洗脫，正負(fù)離子掃描，進(jìn)樣量為5 μL。

1.3.2 含羥基苯甲酸甲酯的順、反丁烯二酸酯類化合物的合成

以順、反丁烯二酸單酯和o,m,p-羥基苯甲酸甲酯為起始原料合成含羥基苯甲酸甲酯單元的順、反丁烯二酸酯類化合物，合成路線如圖1所示。在低溫條件下，將草酰氯（1.7 g、13 mmol）逐滴加入到馬來酸單甲酯（1.1 g、8.5 mmol）、2 滴二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）和無水THF（20 mL）的混合液中，室溫條件下攪拌2 h，反應(yīng)結(jié)束后，旋轉(zhuǎn)蒸餾除去溶劑與殘留的草酰氯，得（Z）-甲基-4-氯-4-羰基-2-丁烯酸酯，加入10 mL無水THF得酰氯混合液。在0 ℃條件下，將酰氯混合液逐滴加入到鄰羥基苯甲酸甲酯（1 g、6.6 mmol）與NaH（0.32 g、13 mmol）在無水THF（15 mL）的反應(yīng)液中，室溫?cái)嚢?～2 h，TLC檢測(cè)，反應(yīng)完之后，用稀鹽酸（1 mol/L）調(diào)節(jié)pH值至4，旋轉(zhuǎn)蒸餾除去溶劑，水相用乙酸乙酯萃?。ü? 次，每次20 mL），合并有機(jī)相用飽和鹽水（20 mL）洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后過濾，蒸餾除去乙酸乙酯得無色油狀液體，硅膠層析柱對(duì)產(chǎn)物分離純化（乙酸乙酯-石油醚體積比10∶1），得化合物1。

其他化合物采用相同的合成方法。

圖1 含羥基苯甲酸甲酯單元的順、反丁烯二酸酯類化合物的合成路線Fig.1 Synthetic route of cis/trans-but-2-enedioic acid esters containing a hydroxybenzoic acid methyl ester moiety

1.3.3 抑菌活性分析

1.3.3.1 菌懸液的制備

豬霍亂沙門氏菌豬霍亂亞種和乳酸鏈球菌乳亞種接種于NB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h，枯草芽孢桿菌接種于NB培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng)24 h，之后稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋∣D625nm=1.1～1.3），濃度約108CFU/mL[20]；酵母接種于SDB培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)24 h后，稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋∣D530nm=1.1～1.3），濃度約106CFU/mL[21]；霉菌接種于SDA斜面培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)5 d后，用無菌生理鹽水（0.85%）沖洗并調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋∣D530nm= 1.3～1.5），孢子濃度約為106CFU/mL[22]。然后用相應(yīng)的培養(yǎng)基將細(xì)菌懸液、酵母懸液和孢子懸液以1∶50稀釋至最終濃度104CFU/mL。

1.3.3.2 最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測(cè)定

含羥基苯甲酸甲酯的順、反丁烯二酸酯類化合物和對(duì)照藥品（富馬酸單甲酯（monomethyl fumarate，MMF）和對(duì)羥基苯甲酸甲酯（methyl 4-hydroxybenzoate，MP））溶于DMSO中，然后加入到以上稀釋好的菌懸液中，使之最終質(zhì)量濃度分別為18.75、25、37.5、50、75、100、150、200 μg/mL和100、200、300、400、600、800 μg/mL。細(xì)菌和酵母在對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，霉菌在SDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。DMSO在培養(yǎng)基中的最終濃度不超過2%。在強(qiáng)光下，清澈透明、無可見微生物生長，化合物的質(zhì)量濃度最低值即為MIC值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 含羥基苯甲酸甲酯的順、反丁烯二酸酯類化合物結(jié)構(gòu)的表征

2-（甲氧基羰基）苯基甲基馬來酸酯的合成（化合物1）：1.20 g白色固體，產(chǎn)率69%，熔點(diǎn)（melting point，mp）：45～46 ℃，HPLC（254 nm）：98.9%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 7.98（dd, J=7.8, 1.6 Hz, 1H)、7.73（td, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H）、7.46（td, J =7.7,1.1 Hz, 1H）、7.35（dd, J = 8.1, 0.8 Hz, 1H）、7.01 （d, J = 0.5 Hz, 2H）、3.79（s, 3H）、3.76（s, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 164.90、164.40、163.27、149.62、134.88、134.72、132.41、131.54、127.04、124.08、122.84、52.67、52.53；MS（ESI）m/z 248.8 [M-CH3]-；C13H12O6元素分析計(jì)算值：C 59.09，H 4.58；實(shí)測(cè)值：C 58.23，H 4.69。

2-（甲氧基羰基）苯基甲基富馬酸酯（化合物2）：1.30 g白色固體，產(chǎn)率74.7%，mp：47～48 ℃，HPLC（254 nm）：97.9%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 7.99（dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H）、7.74（td, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H）、7.47（td, J = 7.7, 1.0 Hz, 1H）、7.36（dd, J = 8.1, 0.8 Hz, 1H）、7.01 （s, 2H）、3.80（s, 3H）、3.77（s, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 164.66、164.16、163.03、149.39、134.64、134.47、132.18、131.30、126.79、123.84、122.61、52.43、52.28；MS（ESI）m/z 248.8 [M-CH3]-；C13H12O6元素分析計(jì)算值：C 59.09，H 4.58；實(shí)測(cè)值：C 58.20，H 4.56。

3-（甲氧基羰基）苯基甲基富馬酸酯（化合物3）：1.26 g白色固體，產(chǎn)率72.4%，mp：75～76 ℃，HPLC（254 nm）：96%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 7.93～7.87（m, 1H）、7.84～7.79（m, 1H）、7.63（t, J = 7.9 Hz, 1H）、7.55（ddd, J = 8.1, 2.2, 1.0 Hz, 1H）、7.00（s, 2H）、3.87（s, 3H）、3.80（s, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 165.33、164.67、162.92、150.07、134.41、132.40、131.09、130.17、126.94、126.59、122.31、52.41、52.37；MS（ESI）m/z 248.8 [M-CH3]-；C13H12O6元素分析計(jì)算值：C 59.09， H 4.58；實(shí)測(cè)值：C 59.41，H 4.71。

4-（甲氧基羰基）苯基甲基富馬酸酯（化合物4a）：1.50 g白色固體，產(chǎn)率86.2%，mp：111～112 ℃，HPLC（254 nm）：96.6%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 8.08～8.05（m, 1H）、8.05～8.03（m, 1H）、7.43～7.41（m, 1H）、7.41～7.38（m, 1H）、7.01（s, 2H）、3.87（s, 3H）、3.79（s, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 165.45、164.63、162.61、153.66、134.63、132.28、130.84、127.57、122.08、52.44、52.25；MS（ESI）m/z 248.8 [MCH3]-；C13H12O6元素分析計(jì)算值：C 59.09，H 4.58；實(shí)測(cè)值：C 57.68，H 4.79。

4-（甲氧基羰基）苯基乙基富馬酸酯（化合物4b）：1.42 g白色固體，產(chǎn)率77.6%，mp：69～70 ℃，HPLC（254 nm）：97.3%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 8.07～8.05（m, 1H）、8.05～8.03 （m, 1H）、7.43～7.41（m, 1H）、7.41～7.38（m, 1H）、6.99（s, 2H）、4.25（q, J = 7.1 Hz, 2H）、3.87（s, 3H）、1.28（t, J = 7.1 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 165.44、164.10、162.60、153.66、134.95、132.12、130.82、127.55、122.06、61.26、52.22、13.89； MS（ESI）m/z 248.8 [M-CH2CH3]-；C14H14O6元素分析計(jì)算值：C 60.43，H 5.07；實(shí)測(cè)值：C 60.23，H 5.05。

4-（甲氧基羰基）苯基丙基富馬酸酯（化合物4c）：1.50 g白色固體，產(chǎn)率78.1%，mp：59～60 ℃，HPLC（254 nm）：98.2%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 8.07～8.05（m, 1H）、8.05～8.02 （m, 1H）、7.43～7.41（m, 1H）、7.41～7.38（m, 1H）、7.00（s, 2H）、4.17（t, J = 6.6 Hz, 2H）、3.87（s, 3H）、1.73～1.59（m, 2H）、0.94（t, J = 7.4 Hz, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 165.44、164.18、162.61、153.67、134.92、132.13、130.82、127.55、122.06、66.61、52.22、21.37、10.14；MS（ESI）m/z 248.8 [M-CH2CH2CH3]-；C15H16O6元素分析計(jì)算值：C 61.64，H 5.52；實(shí)測(cè)值：C 61.12，H 5.40。

2.2 含羥基苯甲酸甲酯的順、反丁烯二酸酯類化合物的合成

合成2-（甲氧基羰基）苯基甲基馬來酸酯（化合物1）的過程中，采用了Na2CO3、三乙胺、吡啶和NaH作為縛酸劑，THF和二氯甲烷（dichloromethane，DCM）為溶劑，其他反應(yīng)條件不變，薄層層析（thin-layer chromatography，TLC）檢測(cè)顯示NaH作為縛酸劑時(shí)，才有產(chǎn)物生成（表1）。由此可以推斷，鄰羥基苯甲酸甲酯中羥基氫與羰基之間形成了氫鍵，氫離子被束縛不易離去；甲酸甲酯的吸電子效應(yīng)降低了羥基氧的電子密度，導(dǎo)致羥基的親核能力降低，二者的共同作用使得鄰羥基苯甲酸甲酯與酰氯的反應(yīng)活性降低或者很難發(fā)生反應(yīng)。選用強(qiáng)堿NaH與鄰羥基苯甲酸甲酯反應(yīng)生成鹽離子，破除氫鍵，增強(qiáng)氧的親核性，促使氧離子與酰氯發(fā)生反應(yīng)，生成產(chǎn)物和NaCl，而不是醇與酰氯反應(yīng)生成產(chǎn)物與HCl，HCl與縛酸劑結(jié)合促進(jìn)反應(yīng)平衡向產(chǎn)物方向移動(dòng)。為保持實(shí)驗(yàn)的一致性，其他化合物采用相同的方法合成。

表1 縛酸劑對(duì)醇解反應(yīng)的影響Table 1 Effect of different acid-binding agents on the alcoholysis reaction

2.3 含羥基苯甲酸甲酯的順、反丁烯二酸酯類化合物的結(jié)構(gòu)分析

圖2 化合物1和化合物2的1H NMR（a）和13C NMR（b）譜圖Fig.21H NMR (a) and13C NMR (b) spectra of compounds 1 and 2

化合物1～3、4a～4c的1H NMR譜圖中，苯環(huán)質(zhì)子峰在δ 7.35～8.08范圍內(nèi)，不飽和雙鍵的質(zhì)子峰在δ 7.00左右且表現(xiàn)為單峰；13C NMR譜圖中，酯碳的特征峰在δ 162～165左右，苯環(huán)和不飽和雙鍵的碳峰在δ 122～153范圍內(nèi)。由圖2可知，化合物1和2 的1H NMR和13C NMR譜圖極其相似，難以區(qū)分。但是它們的熔點(diǎn)不同，化合物1的熔點(diǎn)為45～46 ℃，化合物2的熔點(diǎn)為47～48 ℃，因此可依據(jù)熔點(diǎn)分辨化合物1和2。

2.4 抑菌活性

化合物1～3、4a～4c和對(duì)照藥品（富馬酸單甲酯和對(duì)羥基苯甲酸甲酯）對(duì)8 種供試菌的最低抑菌濃度見表2。結(jié)果表明：相比于MMF和MP，化合物1～3、4a～4c對(duì)供試菌的抑菌活性更強(qiáng)；絕大多數(shù)化合物在200 μg/mL內(nèi)能抑制供試菌的生長；化合物1～3、4a～4c對(duì)真菌和革蘭氏陽性菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。尤其值得注意的是：反式化合物2的抑菌活性強(qiáng)于順式化合物1；對(duì)位化合物4a的抑菌活性強(qiáng)于鄰位化合物2和間位化合物3；化合物4a、4b和4c的抑菌活性結(jié)果顯示烷基鏈的長度能顯著的改變抑菌活性，隨著烷基鏈的增加，MIC值也隨之增大。綜合以上結(jié)果，4-（甲氧基羰基）苯基甲基富馬酸酯（4a）的抑菌活性最強(qiáng)，而且對(duì)細(xì)菌和真菌都有著較好的抑菌效果，也意味著化合物4a可作為潛在的食品防腐劑。

表2 化合物1～3、4a～4c和對(duì)照藥品的體外抑菌活性Table 2 in vitro antimicrobial activities of compound 1 through 3 and 4a through 4c, and reference drugs

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以順、反丁烯二酸單酯和o,m,p-羥基苯甲酸甲酯為起始原料合成了6 種新型的含羥基苯甲酸甲酯的順、反丁烯二酸酯類化合物。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1～3、4a～4c對(duì)供試菌有著較好的抑菌效果，其抑菌活性強(qiáng)于富馬酸單甲酯和對(duì)羥基苯甲酸甲酯。尤其是化合物4a對(duì)供試菌的抑菌活性最強(qiáng)（MIC≤75 μg/mL），可作為潛在的食品防腐劑。

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[20] Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). ISO/TC 212 and ISO/TC 76—2006 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standard-Seventh Edition, M7-A7[S]. USA: CLSI, 2006.

[21] Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). ISO/TC 212 and ISO/TC 76—2002 Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard-Second Edition, M27-A2[S]. USA: CLSI, 2002.

[22] Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). ISO/TC 212 and ISO/TC 76—2008 Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Approved Standard-Second Edition, M38-A2[S]. USA: CLSI, 2008.

Synthesis and Antimicrobial Activity of Novel cis/trans-But-2-Enedioic Acid Esters Containing a Hydroxybenzoic Acid Methyl Ester Moiety

MA Yan-long1,2, ZHOU Ru-jin1,2,*, ZENG Xing-ye2, QIU Song-shan2, NIE Li-jun2
(1. School of Biological and Chemical Engineering, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212003, China; 2. College of Chemical Engineering, Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming 525000, China)

Six novel cis/trans-but-2-enedioic acid esters containing a hydroxybenzoic acid methyl ester moiety were synthesized as potential food preservatives, aiming to discover the new bioactive molecules that can kill food-related bacteria and fungi, and their structures were characterized by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) and elemental analysis. The antimicrobial activity assays in vitro showed that these compounds had strong bioactivity against all eight microorganisms tested. Among the most promising antibacterial and antifungal compounds, 4-(methoxycarbonyl) phenyl methyl fumarate (4a) showed the best antimicrobial activity, and it was effective against S. cerevisiae, A. fl avus and P. chrysogenum with minimal inhibition concentration (MIC) of 25, 37.5 and 37.5 μg/mL, respectively.

cis/trans-but-2-enedioic acid esters; synthesis; antimicrobial activity

TS202.3

A

1002-6630（2014）17-0118-05

10.7506/spkx1002-6630-201417024

2013-10-25

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2009B090300134）；廣東省高等學(xué)校高層次人才項(xiàng)目

馬延龍 （1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橛袡C(jī)食品防腐劑。E-mail：ma880927@163.com

*通信作者：周如金（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橛袡C(jī)食品。E-mail：rujinzhou@126.com