張 新，張紅城，董 捷，張根生*

蜂王漿主蛋白1低聚體的分離純化及其圓二色譜分析

張 新1,2，張紅城2，董 捷2，張根生1,*

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂產(chǎn)品加工分中心，北京 100093）

蜂王漿主蛋白1（major royal jelly protein 1，MRJP1）是蜂王漿主蛋白家族中最重要的成員之一，MRJP1存在單體和低聚體兩種形式。為了研究MRJP1低聚體的二級結構信息，首先利用ToyoScreen GigaCap Q-650M離子交換柱從新鮮蜂王漿中純化出MRJP1低聚體，經(jīng)分析超速離心和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術鑒定其為MRJP1低聚體后，再通過圓二色譜技術檢測MRJP1低聚體在不同濃度Ca2+條件下（10、50、200 mmol/L）二級結構的變化情況，并測定其變性溫度。結果表明：該分離方法可以一步純化出MRJP1低聚體，MRJP1低聚體的二級結構中β-折疊占比最高（55%左右），其次是無規(guī)卷曲（20%左右）和α-螺旋（15%左右），β-轉角（10%左右）含量最低；MRJP1低聚體的變性溫度為55 ℃。實驗提出了MRJP1低聚體新的純化方法及其二級結構的基本信息。

蜂王漿；MRJP1；純化；圓二色譜

蜂王漿（royal jelly，RJ）是5～15 日齡工蜂舌腺和上顎腺所分泌的乳白色或淡黃色乳狀液體，主要用于飼喂蜂王及3 日齡內(nèi)的蜜蜂幼蟲，是蜂王幼蟲整個發(fā)育期和雄蜂幼蟲前期的唯一食物[1-2]。蜂王漿具有多種生物功能，如抗氧化[3]、抗腫瘤[4-5]、抗菌[6]、降血壓[7]、降血脂[8]以及對糖尿病有一定 的治療作用[9]等。

新鮮蜂王漿中蛋白質(zhì)含量豐富，占蜂王漿總量的12%～15%。蜂王漿中的蛋白質(zhì)包括水溶性蛋白和水不溶性蛋白，其中水溶性蛋白占蜂王漿蛋白的46%～89%，為蜂王漿蛋白的主要組成，故稱為蜂王漿主蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）家族[10-12]。MRJPs作為一個蛋白質(zhì)家族，目前已被鑒定出10個家族成員，它們包括MRJP1～9、MRJPψ[13]。MRJPs被報道具有多種生物學功能和保健功效，如參與了蜜蜂的級型分化[14]，在幼蟲的發(fā)育過程中提供可利用的氮元素，以及在蜜蜂行為調(diào)控中起一定作用、促進細胞增殖、高效的抗菌活性、較強的免疫活性和抗氧化活性等[15-16]。MRJP1在蜂王漿蛋白中含量最為豐富，占蜂王漿水溶性蛋白的48%，等電點為4.0～6.3，在蜂王漿中呈現(xiàn)單體和低聚體兩種形式。MRJP1在不同的生物系統(tǒng)內(nèi)顯示出不同的生物活性，如MRJP1能刺激人淋巴細胞在無血清的培養(yǎng)基里生長，也能促進小鼠肝細胞的增殖能力，并表現(xiàn)出一定的抗疲勞功效[17-18]。Kamakura等[19]通過研究首次指出蜂王漿中的MRJP1單體是蜜蜂級型分化的主要決定因子。由于MRJPs家族中各個成員之間的生理活性功能不盡相同，所以有必要針對MRJPs中的單一蛋白成分——尤其是MRJP1低聚體，進行分離純化研究。

MRJPs家族各個蛋白成員之間的等電點和分子質(zhì)量都較為接近，分離純化比較困難。迄今為止，國內(nèi)外對MRJP1的分離純化方法，主要集中于離子交換和凝膠過濾層析。Schmitzová等[11]利用DEAE-52離子交換柱，經(jīng)兩次上柱，分離出MRJP1、2兩種蛋白，由于其反復分離，導致蛋白損失過多，得率低；Simúth[1]用超速離心和凝膠過濾相結合的方法分離鑒定出MRJP1單體和低聚體；Tamura等[20]用Superose 12凝膠柱和Mini Q陰離子交換柱分離得到了MRJP1低聚體，然而因其使用兩種柱子相結合的方式，所以同樣出現(xiàn)蛋白損失問題；Cruz等[21]只采用Mono Q柱分離純化出MRJP1和MRJP2，但是并沒有鑒定出此MRJP1為單體還是低聚體。因此有必要研究出一種簡單的MRJP1低聚體的分離純化方法，從而可以得到足夠的MRJP1低聚體進行結構研究。

圓二色譜（circular dichroism，CD）是研究蛋白質(zhì)二級結構的常用方法，它是利用偏振光在通過光學活性物質(zhì)后某些性質(zhì)發(fā)生變化來了解分子本身的結構及其變化的技術。蛋白質(zhì)的二級結構，如α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲等在其各自特定的波長下都對應有不同的CD譜型，通過CD可以獲得蛋白質(zhì)二級結構的信息和了解構象的變化[22-23]。圓二色譜分為同步輻射真空紫外圓二色譜（synchrotron radiation circular dichroism，SRCD）和普通CD，它們最大的區(qū)別在于波長范圍不同。SRCD比CD有進一步的優(yōu)越性，SRCD的波長可向短波方向的近紫外區(qū)拓展到160 nm，其優(yōu)點是伴隨新的電子躍遷，對應有新的光譜結構，所包含的結構信息就越豐富，所確定的結構就越精確[24]。Biliková等[25]利用CD技術測定蜂王漿蛋白中Apisimin的二級結構與生物信息學預測結果一致；Cruz等[21]利用CD研究發(fā)現(xiàn)，2 mmol/L的Ca2+的存在使得MRJP1單體的二級結構具有極高的穩(wěn)定性。

本實驗擬利用陰離子交換層析篩選優(yōu)化，得到一種簡單的分離MRJP1低聚體的方法，并采用分析超速離心和質(zhì)譜共同對其進行鑒定。此外，實驗中還利用SRCD技術探究不同Ca2+濃 度對MRJP1低聚體二級結構變化的影響，及測定MRJP1低聚體的變性溫度（Tm）。為下一步研究MRJP1低聚體的生理活性功能以及其在貯存條件下結構變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂王漿樣品采自中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所育蜂基地，采收后置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

氨基丁三醇（Tris） 美國Sigma公司；鹽酸、氯化鈉 北京化工廠；H2O2天津市華東試劑廠；聚丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍R-250 北京索來寶（Solarbio）試劑公司；Marker 北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

北京同步輻射真空紫外圓二色譜裝置 中國科學院高能物理研究所；AKTA Purifier 100全自動層析儀 美國GE Healthcare公司；離子交換柱ToyoScreen GigaCap Q-650M（5 mL） 日本東曹 生物科技有限公司；Sorvall Biofuge Startos型離心機 德國Thermo Scientific公司；HPLC1100 美國Agil ent公司；LCQ Deca XP電噴霧質(zhì)譜 美國T hermo Fisher公司；Mini-Protean II型電泳儀 美國Bio-Rad公司；Beckman/Coulter/XL-I型分析超速離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；PL303型電子分析天平、SevenEasy型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Amicon Ultra超濾管（30 ku） 美國Millip ore公司。

1.3 方法

1.3.1 MRJP1的分離純化

新鮮蜂王漿1.0 g溶于10 mL緩沖液（30 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0），充分攪拌溶解混勻后，于4 ℃、15 000×g離心30 min。取上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液即為蜂王漿粗提液。使用陰離子交換層析對蜂王漿進行分離純化，將ToyoScreen GigaCap Q-650M柱與AKTA purifier 100全自動層析儀連接，由Unicron 5.2操作系統(tǒng)調(diào)控。蜂王漿粗提液通過注射器經(jīng)2.0 mL上樣環(huán)手動上樣，起始緩沖液A（30 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0），洗脫緩沖液B（30 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，pH 9.0），使用起始緩沖液A對整個系統(tǒng)進行平衡后，再使用0～50%洗脫緩沖液B進行線性洗脫100 mL，流速為2.0 mL/min，檢測波長為280 nm，洗脫樣品由AKTA purifier以每管1.0 mL自動收集，4 ℃保存?zhèn)溆?。收集的樣品使用質(zhì)量分數(shù)為10%的分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）鑒定，并檢測蛋白的純度和分子質(zhì)量。

1.3.2 MRJP1低聚體的分析超速離心

分析超速離心主要是利用沉降速度來測定分子質(zhì)量。采用Beckman/Coulter/XL-I分析超速離心機，溫度為20 ℃，用照相方式記錄樣品粒子在高速離心下的運動狀態(tài)，計算出粒子的沉降系數(shù)，將其代入Svedberg方程式，可求出分子或粒子的分子質(zhì)量。MRJP1低聚體樣品溶于緩沖溶液（30 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 9.0），上樣濃度為1、2 μmol/L，轉速為40 000×g。緩沖液的密度和黏度，蛋白質(zhì)的微分比容通過SEDNTERP程序獲得。沉降速率和沉降平衡的數(shù)據(jù)通過SEDFIT和EDPHAT程序分析。

1.3.3 MRJP1低聚體的質(zhì)譜鑒定

將分離得到的純化蛋白濃縮至2 mg/mL后取100 μL，加入100 μg胰蛋白酶，輕柔混合均勻后，在37 ℃條件下酶切過夜。取30 μL酶解產(chǎn)物直接上樣進行質(zhì)譜分析。使用Zorbax SB C18色譜柱，ESI電噴霧離子源噴霧電壓4.5 kV，加熱電壓25 V，離子導入電壓20 V，離子傳輸毛細管溫度300 ℃，掃描范圍m/z 50～2 000，碰撞能量為35%，質(zhì)譜信號為多次累加掃描。采用標準蛋白混合物作外標標定多肽質(zhì)譜峰峰位，最后通過Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫對得到的多肽片段與蜂王漿蛋白進行檢索鑒定。

1.3.4 MRJP1低聚體的CD分析

將MRJP1低聚體溶液置于30 ku超濾管中，利用反復濃縮的方法將Tris-HCl緩沖液替換成磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 8.0），用0.22 μm濾膜過濾后，根據(jù)儀器響應水平將蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度調(diào)整為5 mg/mL。首先，分別添加不同濃度的Ca2+（10、50、200 mmol/L），并設置對照組（0 mmol/L）為不加Ca2+的天然MRJP1低聚體。研究Ca2+濃度對MRJP1二級結構的影響；由于α-螺旋在222 nm波長處有負特征吸收峰，因此本實驗選擇222 nm波長來檢測MRJP1低聚體的Tm值。

貯存環(huán)的電子能量為1.5 GeV，束流強度為450 mA。波長掃描范圍為175～260 nm，步長1.0 nm，CaF2樣品池厚度0.001 mm，停留時間1 min，掃描次數(shù)5 次，測量溫度為25 ℃。Tm值測定的初始檢測溫度為10 ℃，隨后每2 ℃為一個梯度，溫度依次上升至80 ℃，到達每個溫度穩(wěn)定5 min后檢測222 nm波長處CD吸收值。利用CD Tool軟件對CD譜進行數(shù)據(jù)處理，扣除對照樣品的CD信號后對數(shù)據(jù)進行濃度、光程長歸一化，分別計算α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲的含量及Tm值。

2 結果與分析

2.1 MRJP1的分離純化結果

蜂王漿粗取液里含有的MRJPs主要為MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP5[11]。MRJP1、MRJP2的等電點為4.0～6.3、6.2～7.9；利用生物信息學查得MRJP3、MRJP5理論等電點分別為6.87、8.94。由于MRJPs等電點不同，并且大部分都是酸性蛋白，因此選擇陰離子交換法來分離蜂王漿蛋白。

本實驗室前期對離子交換層析過程使用的Tris-HCl緩沖液的pH 8.0、9.0、10.0和濃度10、20、30 mmol/L及不同的日本東曹公司柱材（ToyoScreen GigaCap Q-650M，ToyoScreen Q-600C AR，ToyoScreen DEAE-650M，ToyoScreen SuperQ-650M和ToyoScreen QAE-550）的選擇進行了優(yōu)化。篩選出最適合的緩沖液為pH 9.0的30 mmol/L Tris-HCl，最優(yōu)的柱子為ToyoScreen GigaCap Q-650M柱。在此條件下，分離MRJPs的離子交換層析圖譜如圖1所示。

圖1 陰離子交換層析分離純化MRJP1的色譜圖及其電泳檢測圖Fig.1 Anion-exchange chromatography and SDS-PAGE analysis of MRJP1

由圖1可知，使用陰離子交換層析可以分離純化出MRJP1。將收集到的每個峰的組分進行SDS-PAGE電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)P4、P5的蛋白組分為純化單一組分，與蜂王漿粗提液和Marker分子質(zhì)量對比，初步判斷P4、P5峰均含有MRJP1。由于MRJP1為弱酸性蛋白，因此與其他弱堿性蜂王漿蛋白相比，在pH 9.0堿性分離條件下，MRJP1帶有負電荷最多，與陰離子交換柱結合最緊密，所以最后被洗脫下來，從而與其他蛋白分離開來。研究表明MRJP1是分子質(zhì)量約為49～60 kD的弱酸性糖蛋白[11]，可以形成290～420 kD的低聚體[1,25-26]；由于低聚體在此緩沖液下帶有的負電荷比單體多，因此推測P4組分可能為單體，P5組分可能為低聚體。P0～P3中并無MRJP1出現(xiàn)，說明MRJP1完全被分離開。

2.2 MRJP1低聚體質(zhì)譜鑒定

為進一步確認分離純化得到的蛋白是MRJP1，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法對此蛋白進行驗證。MRJP1低聚體樣品經(jīng)胰蛋白酶消化，酶切位點為精氨酸和賴氨酸，形成的多肽片段進入質(zhì)譜，一級質(zhì)譜檢測多肽分子的大小，然后再將肽段打碎，形成一系列離子，質(zhì)譜再檢測碎片離子的大小，即二級質(zhì)譜。被打碎的40 個多肽片段中，25 個多肽片段通過SwissProt數(shù)據(jù)庫檢索與蜂王漿蛋白家族的成員序列進行匹配。其中，分子質(zhì)量較大的6 個多肽片段為NNYPSDIDQWHDK，YNGVPSSLNVISK，LLTFDLTTSQLLK，TSDYQQNDIHYEGVQNILDTQSSAK，SGVLFFGLVGDSALGCWNEHR，和IMNANVNELILNTR。其匹配情況如圖2所示，與MRJP1的匹配得分最高，且為唯一及格蛋白，序列覆蓋率為53.47%，故經(jīng)生物信息學比對結果進一步確認該蛋白為蜂王漿主蛋白成分MRJP1。

圖2 MRJP1低聚體的質(zhì)譜肽段碎片匹配情況Fig.2 Polypeptide matching of MRJP1 oligomer

2.3 MRJP1低聚體分子質(zhì)量的測定結果

將ToyoScreen GigaCap Q-650M柱分離得到的P4和P5組分，濃縮并除鹽后分別過Superdex 200凝膠過濾層析，發(fā)現(xiàn)P4組分含有雙峰，含有MRJP1單體和低聚體；P5組分為單峰，其主成分為MRJP1低聚體。為了進一步驗證P5組分為低聚體，對樣品進行了分析超速離心來測定其分子質(zhì)量。通過拍照得到的沉降系數(shù)等數(shù)據(jù)通過SEDFIT和EDPHAT程序分析，即可得到樣品中粒子的分子質(zhì)量。

圖3 P5組分中MRJP1低聚體分析超速離心實驗譜圖Fig.3 Identification of MRJP1 oligomer from P5 fraction by sedimentation equilibrium

如圖3所示，分析超速離心實驗主峰對應的分子質(zhì)量約為238 kD，由于MRJP1的分子質(zhì)量約為49～60 kD[6]，Tamura等[14]通過雙向電泳將MRJP1低聚體分成55、5 kD兩部分，因此推測此238 kD的MRJP1低聚體很可能為四聚體，即由4 個MRJP1單體和4 個5 kD單體組成了MRJP1低聚體。

2.4 MRJP1低聚體的CD分析

2.4.1 不同Ca2+濃度對MRJP1低聚體二級結構的影響

表1 MRJP1低聚體二級結構隨Ca2+濃度變化情況Table 1 Changes in secondary structures of MRJP1 oligomer in the presence of Ca2+ at various concentrations

MRJP1低聚體通過SRCD分析，用CD Tool和CD SSTR算法處理其圖譜。如表1所示，得到天然MRJP1低聚體的二級結構比例，其中，β-折疊所占比例最高（54.4%左右），其次是無規(guī)卷曲（19.8%左右）和α-螺旋（13.1%左右），β-轉角（12.6%左右）含量最低。劉娟[27]研究新鮮蜂王漿蛋白中，β-折疊結構占26.7%，α-螺旋結構占22.8%，β-轉角結構占23.7%，不規(guī)則結構占16.7%，其結構比例接近1∶1∶1∶1。MRJP1在蜂王漿蛋白中含量接近1/2，而本實驗發(fā)現(xiàn)MRJP1低聚體中，β-折疊結構高達50%以上，故推測蜂王漿中β-折疊結構，主要來自MRJP1低聚體，其他蛋白含有的α-螺旋、β-轉角所占比例會較高。

在3 種Ca2+濃度（10、50、200 mmol/L）條件下，MRJP1低聚體的二級結構比例與對照組相差不大，即Ca2+的濃度對其二級結構比例影響不大，隨Ca2+濃度的升高，α-螺旋、β-折疊和β-轉角所占比例稍有降低，無規(guī)卷曲所占比例略有增加。Cruz等[21]研究2 mmol/L Ca2+對MRJP1結構的影響不大，而本實驗在高Ca2+濃度的情況下，MRJP1低聚體總體結構變化依然很小，說明Ca2+濃度對MRJP1低聚體二級結構確實影響不大。

2.4.2 MRJP1低聚體的Tm值

當?shù)鞍踪|(zhì)溶液被逐漸加熱并超過臨界溫度時，溶液中的蛋白質(zhì)將發(fā)生從天然狀態(tài)向變性狀態(tài)的劇烈轉變，此轉變溫度被稱作變性溫度（Tm），此時蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)和變性狀態(tài)的濃度之比為1∶1。由圖4可知，MRJP1低聚體的Tm值約為55 ℃，表明MRJP1低聚體在55 ℃前熱穩(wěn)定性很好，其二級結構基本上沒有變化；55 ℃以后，二級結構逐漸變化，熱穩(wěn)定性變差。因此，蜂王漿在低溫和常溫貯藏過程中，MRJP1低聚體的結構一般不會發(fā)生變化。Simúth[1]發(fā)現(xiàn)MRIP1低聚體在37 ℃條件下貯藏12 h后仍無降解跡象；Kamakura等[18]發(fā)現(xiàn)MRJP1低聚體在40 ℃條件下保存30 d后只降解10%；Tamura等[20]指出，MRJP1低聚體高級結構在56 ℃環(huán)境下保持30 min也不會有大的改變。這些結果與本實驗測得MRJP1低聚體的變性溫度為55 ℃相符，低于變性溫度情況下MRJP1低聚體結構穩(wěn)定。

圖4 MRJP1低聚體熱變性圖Fig.4 Thermal denaturation curve of MRJP1 oligomer

3 結 論

本實驗根據(jù)蜂王漿蛋白的性質(zhì)，使用ToyoScreen GigaCap Q-650M陰離子交換柱優(yōu)化出一種新的分離MRJP1低聚體的方法，相對于其他需要至少兩種柱層析方法更方便高效。在對蜂王漿進行前處理過程中，前人大多采用透析的方式，需要消耗2～3 d；而本實驗對蜂王漿的前處理只需要30 min，純化過程也在1 h內(nèi)完成，既節(jié)省了步驟，也節(jié)約了時間，適合大規(guī)模純化MRJP1低聚體，從而進行功能性質(zhì)的研究。為了鑒定此MRJP1為低聚體，本實驗首次采用分析超速離心來 精確測定其分子質(zhì)量為238 kD，并推測其為MRJP1四聚體。隨后，本實驗利用SRCD技術研究MRJP1低聚體二級結構，β-螺旋所占比例最高，均占55%左右；其次是無規(guī)卷曲和α-螺旋，分別約占20%和15%；β-轉角含量最低，占10%左右。并測定MRJP1低聚體的變性溫度為55 ℃。

總之，本實驗提出了MRJP1低聚體新的純化方法及其二級結構的基本信息，為下一步研究MRJP1低聚體的生理活性功能以及其在貯藏存條件下結構變化打下了基礎。

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Purification and Circular Dichroism Analysis of MRJP1 Oligomer from Royal Jelly

ZHANG Xin1,2, ZHANG Hong-cheng2, DONG Jie2, ZHANG Gen-sheng1,*
(1. College of Food Science, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. National R&D Centre for Bee Product Processing, Ministry of Agriculture, Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

MRJP1 is one of the most important members in the Major Royal Jelly Proteins (MRJPs) family with monomeric and oligomeric forms in royal jelly. In order to investigate the secondary structure of RJP1 oligomer, MRJP1 oligomer was extracted from fresh royal jelly and purified by ToyoScreen GigaCap Q-650M anion exchange column, then identified by sedimentation equilibrium and liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Afterwards, we detected MRJP1 oligomer by synchrotron radiation circular dichroism (SRCD) to clarify the correlation between its secondary structure and different con centration of Ca2+(10, 50 and 200 mmol/L). In addition, its Tmvalue was also determined. The results showed that the proportion of β-strand (about 55%) was the highest, followed in decreasing order by random coil (20%) and α-helix (15%) and β-turns (10%). Ca2+had little effect on the secondary structure of MRJP1 oligomer. The Tmvalue of MRJP1 oligomer was 55 ℃. To conclude, a new method for the purification of MRJP1 oligomer and information on its secondary structure have been presented in this study.

royal Jelly; MRJP1; purification; circular dichroism (CD)

TS201.2

A

1002-6630（2014）17-0063-05

10.7506/spkx1002-6630-201417013

2013-11-10

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蜂）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-45-KXJ18）；中國農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項（2012ZL074）

張新（1988—），女，碩士研究生，研究方向為傳統(tǒng)食品工業(yè)化。E-mail：249193138@qq.com

*通信作者：張根生（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品科學與工程。E-mail：zhanggsh@163.com