■管軍軍 李世豪 韓丙倩 程云龍

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

固態(tài)發(fā)酵豆粕，是利用固態(tài)發(fā)酵手段，將豆粕這種植物源蛋白與微生態(tài)技術(shù)相結(jié)合，提升豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善豆粕適口性的技術(shù)。固態(tài)發(fā)酵豆粕是目前研究的熱點(diǎn)，隨著發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)酵豆粕的品質(zhì)也不斷提高，不過(guò)發(fā)酵過(guò)程中依然有一些問(wèn)題亟待解決。目前對(duì)于發(fā)酵豆粕的研究主要集中在優(yōu)化菌種配比，發(fā)酵條件如發(fā)酵溫度，pH值，發(fā)酵時(shí)間等，但研究豆粕粒度對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響的較少[1]。

固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)粒徑對(duì)發(fā)酵前中后期都有巨大影響，目前對(duì)其研究較少是因?yàn)椴煌陌l(fā)酵基質(zhì)形態(tài)差別較大，其結(jié)果不具有普適性。不過(guò)對(duì)于豆粕來(lái)說(shuō)，由于生產(chǎn)加工手段的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化，豆粕粒度基本保持在一個(gè)可控的范圍內(nèi)[2]，因此研究不同豆粕粒度對(duì)于發(fā)酵結(jié)果的影響具有一定的意義。

豆粕粒徑對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響主要體現(xiàn)在兩點(diǎn)，豆粕間隙含氧量及菌體與基質(zhì)接觸面積。由于固態(tài)發(fā)酵的通風(fēng)散熱相對(duì)液態(tài)發(fā)酵困難，因此，發(fā)酵基質(zhì)間隙氧含量對(duì)于發(fā)酵結(jié)果影響很大；同樣菌體與基質(zhì)接觸面積大，則對(duì)基質(zhì)的降解更加充分，發(fā)酵效率更高[3]。本試驗(yàn)旨在得出豆粕發(fā)酵的最佳粒度，為固態(tài)發(fā)酵豆粕技術(shù)的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

1 試驗(yàn)與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豆粕：粗蛋白含量46%，酸溶性小肽含量1.22%（河南陽(yáng)光油脂集團(tuán)）；枯草芽孢桿菌BS-GA15（潤(rùn)盈生物工程[上海]有限公司）；小分子蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品（Marker）（生工生物工程[上海]有限公司）；其他試驗(yàn)藥品均通過(guò)鄭州新豐化驗(yàn)器材有限公司購(gòu)買(mǎi)。

1.2 主要儀器設(shè)備

XSB-88型頂擊式振動(dòng)機(jī)，篩搖次數(shù)221次/min，振擊次數(shù)147次/min；4～100目分樣篩；SF-400電子秤；SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱；JP-100A-2高速多功能粉碎機(jī)；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)；TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)；JY600C電泳儀；722N可見(jiàn)分光光度計(jì)；DHG-9070B智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 豆粕粒徑分布的測(cè)定

根據(jù)振動(dòng)機(jī)裝填量及對(duì)豆粕粒度的初步判斷選擇4、8、12、16、20、40、60、80、100目孔徑的篩子對(duì)豆粕篩分。為排除取樣誤差，按照四分法，取樣5次，篩子按照孔徑由大到小順序依次向下疊摞。將所取樣品依次加入4目篩中，放入振動(dòng)機(jī)中振動(dòng)10 min，取下篩子，分別稱(chēng)量各個(gè)篩子中豆粕質(zhì)量，計(jì)算平均值，按照質(zhì)量比例確定不同粒徑豆粕在總體中所占比例。

1.3.2 豆粕空隙率的測(cè)定及比表面積

參照GB/T 5518-2008糧食、油料相對(duì)密度的測(cè)定中的量筒法，在室溫（22±5）℃下，向量筒中加入20%乙醇10 ml，然后放入樣品約5 g（精確至0.01 g），稍加搖動(dòng)，逐出氣泡，待液面平穩(wěn)后，立即讀出液面上升體積（V1），稱(chēng)量相同質(zhì)量豆粕，放入量筒中讀出體積（V2）。則空隙率=（V2-V1）/V2。其比表面積根據(jù)豆粕直徑大小計(jì)算得到。

1.3.3 發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.3.1 培養(yǎng)基及發(fā)酵

發(fā)酵選用菌種為枯草芽孢桿菌，在發(fā)酵過(guò)程中，隨著菌體的繁殖，能夠產(chǎn)生大量蛋白酶[4]，促進(jìn)小肽的生成。為了使菌種更好地適應(yīng)固態(tài)發(fā)酵環(huán)境，種子液培養(yǎng)基用優(yōu)化的豆粕培養(yǎng)基：100目以下豆粕40 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L；接種量按照質(zhì)量體積比9∶1接種，即每100 g發(fā)酵基質(zhì)，接種10 ml對(duì)數(shù)期種子液；料水比6∶4；發(fā)酵前，先將種子液混入所需體積水中，搖勻后拌入豆粕中，攪拌均勻后覆蓋8層無(wú)菌紗布進(jìn)行發(fā)酵。

發(fā)酵所用的豆粕是具有代表性的4～8目,16～20目，20～40目，80目以下4種粒徑的豆粕，原始豆粕作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)；發(fā)酵溫度32℃，每12 h取一次樣，共取5次，共計(jì)發(fā)酵時(shí)間60 h。樣品在50℃下烘干8 h，之后粉碎篩選60目以下樣品，測(cè)定其酸溶性小肽的含量，并以其含量的高低判斷發(fā)酵結(jié)果的優(yōu)劣。

1.3.3.2 酸溶性小肽測(cè)定

酸溶性小肽是豆粕中大分子蛋白質(zhì)降解后的產(chǎn)物，研究表明小肽比蛋白質(zhì)、氨基酸更容易吸收，因此酸溶性小肽含量的高低能夠反映發(fā)酵結(jié)果的優(yōu)劣[5]。本試驗(yàn)采用雙縮脲法測(cè)定酸溶性小肽含量。具體方法：稱(chēng)取1 g豆粕樣品，定容于50 ml 15%三氯乙酸溶液中，搖勻后靜置5 min，提取其中的酸溶性蛋白，然后過(guò)濾取濾液；準(zhǔn)確取1 ml濾液于試管中，加入5 ml 0.1 g/ml NaCl溶液，使溶液呈堿性，搖勻后加入1 ml 0.01 g/ml CuSO4溶液并搖勻，反應(yīng)30 min后將反應(yīng)液在4 000 r/min條件下離心5 min。取上清液在540 nm下測(cè)定吸光度。用同樣的方法，測(cè)定一系列已知濃度的牛血清蛋白溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并計(jì)算各樣品中小肽含量。

1.3.3.3 發(fā)酵過(guò)程中豆粕體積變化

豆粕加水后，體積膨脹，發(fā)酵開(kāi)始后，由于水分的蒸發(fā)等因素，豆粕的體積又會(huì)收縮，縮小的體積與發(fā)酵前（加水后）體積的比值記作豆粕體積收縮率（Vs）。Vs在每次取樣前通過(guò)測(cè)定發(fā)酵豆粕界面下降高度計(jì)算得到。這個(gè)數(shù)值能反映發(fā)酵狀態(tài)下豆粕顆粒間氧含量的變化。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)利用SAS 9.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 豆粕粒度分布

按照上述試驗(yàn)方法，對(duì)豆粕進(jìn)行篩分，豆粕全部通過(guò)4目篩，以相鄰篩子孔徑值為區(qū)間，對(duì)豆粕粒徑進(jìn)行劃分。不同粒徑豆粕在總樣品的含量比值見(jiàn)圖1。

圖1 不同粒徑豆粕在總樣品中含量

從圖1可以看到，豆粕中各粒徑分布呈現(xiàn)中間高，兩邊低的趨勢(shì)；16～20目，20～40目的豆粕最多，各占22%，共占所有豆粕的44%，接近一半；8～60目豆粕共占總樣品的86%；說(shuō)明在一定粒徑范圍內(nèi)分布比較集中。發(fā)酵試驗(yàn)選擇4～8目豆粕（其粒徑最大），16～20目豆粕，20～40目豆粕（含量最多），以及粒徑最小的80目以下豆粕，原始豆粕為對(duì)照組，依次將其編號(hào)為A、B、C、D、E。

2.2 豆粕空隙率

參照GB/T 5518-2008所測(cè)得各粒徑空隙率如圖2所示。

圖2 各粒徑豆粕空隙率

從圖2可以看出，空隙率的變化為先降低后升高，其中最低點(diǎn)為20～40目的豆粕。影響豆粕空隙率的因素有豆粕粒徑大小及豆粕顆粒形狀。大粒徑豆粕，容易構(gòu)成大的顆粒間空隙，因此4～40目的豆粕，粒徑越大，空隙率越大；但是40目以下粒徑的豆粕，自身表面有更多的突起，使得堆積狀態(tài)下豆粕顯得更膨松，也就是空隙率更大。顯微鏡下觀察不同粒徑豆粕顆粒，如圖3所示，豆粕顆粒表面是凹凸不平的，并且有許多刺狀或耳裝突起。這些突起使得豆粕堆積期間不能完全整齊排列，形成豆粕間空隙?？障堵适求w現(xiàn)發(fā)酵初期基質(zhì)間氧含量的重要指標(biāo)，氧含量越高，好氧菌的繁殖越快，能夠縮短發(fā)酵時(shí)間。

2.3 不同粒徑豆粕的比表面積

豆粕的比表面積會(huì)影響細(xì)菌與豆粕的接觸面積，發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)菌與豆粕的接觸面積越大，豆粕被分解的速率越大。A、B、C、D、E 5種粒徑的豆粕比表面積基本與直徑成反比。直徑越大，比表面積越小，因此比表面積A＜E＜B＜C＜D。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中體積收縮率的測(cè)定

將樣品A、B、C、D、E按照料水比6∶4加水接種后，在發(fā)酵過(guò)程中，由于水分的蒸發(fā)，微生物的降解，豆粕表面的突起逐漸變小，變平，豆粕顆粒之間距離變小，豆粕總體積降低。發(fā)酵所用的各粒徑豆粕的體積變化如圖4所示。

豆粕體積收縮率表示發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)間隙的減小，這表示豆粕間溶氧的減小，從圖4可以看到，粒徑越大的豆粕，體積收縮越小。這是因?yàn)榱酱蟮亩蛊?，邊緣突起更加?jiān)固，經(jīng)發(fā)酵后還能保持一定的硬度，能夠保持空隙的形成。而粒徑小的豆粕，經(jīng)過(guò)水的浸泡，微生物的侵蝕，硬度降低，凸起的邊緣提供的摩擦力小于豆粕自身的重力，因此豆粕整體體積收縮。

圖3 不同粒徑豆粕顯微觀察

圖4 發(fā)酵過(guò)程中豆粕體積收縮率

2.5 發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中取出的樣品進(jìn)行測(cè)定，其酸溶性小肽含量見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵過(guò)程中不同粒徑豆粕產(chǎn)酸溶性小肽含量(%)

對(duì)24 h各個(gè)樣品，以及80目以下試驗(yàn)組各個(gè)樣品處理后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，觀察豆粕中蛋白分解為酸溶性小肽的情況，如圖5所示。

圖5 各粒度試驗(yàn)組在24 h的發(fā)酵樣品電泳圖

圖5中，1、2、3、4、5對(duì)應(yīng)A、B、C、D、E五種粒度，M為Marker條帶。由圖5可以看出80目以下粒徑試驗(yàn)組在24 h時(shí)，大分子蛋白降解最多，與表1中該取樣點(diǎn)有最優(yōu)試驗(yàn)結(jié)果相符合。

對(duì)同一時(shí)間段的結(jié)果進(jìn)行多重比較，發(fā)酵12 h及24 h，80目以下粒徑豆粕發(fā)酵結(jié)果較其他粒徑極顯著，發(fā)酵結(jié)果最好，而4～8目豆粕酸溶性小肽含量最低；發(fā)酵36 h以后，各粒徑豆粕發(fā)酵結(jié)果差異不顯著；由此可知，豆粕粒徑不同對(duì)于發(fā)酵結(jié)果的影響作用在36 h之前，36 h之后，粒徑因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響不顯著。

由表1可知，發(fā)酵時(shí)間12 h，粒徑最小的豆粕肽含量最高，這與其最大的空隙率成正相關(guān)。但20～40目試驗(yàn)組的肽含量比4～8目及16～20目試驗(yàn)組高，這是因?yàn)?0～40目試驗(yàn)組豆粕比表面積更大，微生物與豆粕接觸面積大，對(duì)豆粕利用效率更高。

整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，酸溶性小肽含量最高值為7.66%，對(duì)應(yīng)樣品為80目以下豆粕，發(fā)酵24 h。可以看出空隙率高，比表面積大對(duì)于前期菌種的繁殖起到了積極的作用。

不過(guò)在36 h以后，除了80目以下試驗(yàn)組酸溶性小肽含量開(kāi)始降低外，其余試驗(yàn)組小肽含量仍呈上升狀態(tài)。結(jié)合發(fā)酵過(guò)程中豆粕體積的收縮率，可以發(fā)現(xiàn)，80目以下豆粕在各個(gè)時(shí)間段體積收縮最多，豆粕間隙越來(lái)越小，36 h時(shí)不能滿(mǎn)足細(xì)菌的繼續(xù)生長(zhǎng)，細(xì)菌進(jìn)入衰退期，反而消耗小肽。而且80目以下豆粕含量只有3%，如果用這個(gè)粒度發(fā)酵則需要對(duì)豆粕進(jìn)行粉碎處理，需要消耗巨大能量，綜合比較，選取含量較多的20～40目豆粕進(jìn)行發(fā)酵較為合適。

3 結(jié)論

豆粕中不同粒徑的豆粕含量分布呈現(xiàn)中間高，兩邊低的趨勢(shì)，并且16～40目的豆粕占到44%的比例。

豆粕的空隙率呈現(xiàn)兩邊高，中間低的趨勢(shì)，最低點(diǎn)出現(xiàn)在20～40目豆粕處，40目以下的豆粕空隙率普遍比40目以上豆粕大。

較大的豆粕空隙率與比表面積都能在一定程度上提升發(fā)酵結(jié)果，但是在它們最大的時(shí)候，豆粕粒徑卻是最小的，在發(fā)酵過(guò)程中，體積收縮率最大，不利于長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵。

最佳發(fā)酵條件為粒徑80目以下豆粕，發(fā)酵24 h，但考慮到80目以下豆粕含量只占3%，因此可以考慮含量最大的粒徑20～40目豆粕發(fā)酵。