■ 楊建松 王 露 劉 燕 王亞軍 王德培，2

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們?cè)絹碓街匾暼馐称分锌股氐臍埩魡栴}[1]。由于抗生素的濫用和耐藥性問題，人們逐漸把目光轉(zhuǎn)向了微生物發(fā)酵飼料的研究[2]，這樣能為生產(chǎn)安全、無毒、無抗生素的肉食品開辟一條新的途徑[3]。

發(fā)酵飼料不僅可以改善飼料營養(yǎng)吸收水平，降解飼料原料中的毒素，還能減少抗生素等藥物類添加劑的使用[4]。發(fā)酵所用的乳酸菌能產(chǎn)生乳酸菌素和大量有機(jī)酸等，同時(shí)形成厭氧環(huán)境，抑制大腸桿菌等致病菌的增殖[5]。芽孢桿菌能產(chǎn)生多肽類抗生物質(zhì)，有益菌的增殖還能激活免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟[6]，這些都與動(dòng)物健康密切相關(guān)。常規(guī)發(fā)酵工藝優(yōu)化多采用將其他因素固定，每次改變一個(gè)因素的方法，這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且容易忽略因子間的交互作用而得出錯(cuò)誤的結(jié)論[7]，響應(yīng)面法可同時(shí)對(duì)各因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，該方法可以簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，提高準(zhǔn)確性[8]。

本文以前期篩所選出的乳酸菌和芽孢桿菌作為肉雞飼料的發(fā)酵菌株，采用固體混菌厭氧發(fā)酵，通過響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵工藝經(jīng)行分析和優(yōu)化。運(yùn)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以及Box-Behnken設(shè)計(jì)得到最佳發(fā)酵工藝，使各個(gè)菌種能夠發(fā)揮優(yōu)勢(shì)，從而制備出較好的無抗肉雞發(fā)酵飼料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌BI1(Bacillus subtilis BI1)、枯草芽孢桿菌 WL-BA-1(Bacillus subtilis WL-BA-1)、豆粕乳桿菌（Lactobacillus soybean meal）、發(fā)酵乳桿菌TLa-6(Lactobacillus fermentum TLa-6)，均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/l）：胰蛋白胨10、酵母浸出粉5、Na-Cl 10，pH值7.2～7.5。

淀粉培養(yǎng)基（g/l）：牛肉膏5、蛋白胨5、NaCl 5、可溶性淀粉20、瓊脂18，pH值7.2。

肉湯培養(yǎng)基（g/l）：牛肉膏5、蛋白胨10、NaCl 5，pH值7.2～7.4。

MRS培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨10、牛肉膏10、酵母浸出粉5、葡萄糖5、CH3COONa 5、檸檬酸二胺2、吐溫80 1、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·7H2O 0.05、CaCO320，pH值6.2。

奶粉培養(yǎng)基(g/l)：脫脂奶粉100、乳糖20，pH值自然。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨20、乳糖10、牛膽鹽5、NaCl 5、中性紅0.03、瓊脂18，pH值7.0。

1.3 飼料

實(shí)驗(yàn)所用飼料由天津牧豐飼料有限公司提供，經(jīng)檢測(cè)其還原糖含量為0.78%，酸溶蛋白含量為0.33%，乳酸和乳酸菌均檢測(cè)不出。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 芽孢桿菌種子液制備

從LB培養(yǎng)基斜面挑取1環(huán)菌，接入到裝有50 ml肉湯液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，放置于溫度37℃、轉(zhuǎn)速220 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)14 h。

1.4.2 乳酸菌種子液制備

從奶粉培養(yǎng)基里吸取2 ml培養(yǎng)液，接入到裝有100 ml MRS液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，放置于溫度42℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 h。

1.4.3 飼料固態(tài)發(fā)酵

將枯草芽孢桿菌BI1、枯草芽孢桿菌WL-BA-1、豆粕乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌TLa-6種子液與一定量的水混合，然后再與肉雞全價(jià)料混勻，將其裝入發(fā)酵瓶置于恒溫箱培養(yǎng)。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 還原糖含量的測(cè)定

采用DNS法測(cè)定發(fā)酵飼料中還原糖的含量。

1.5.2 乳酸含量的測(cè)定

稱取發(fā)酵飼料5.00 g置于裝有50 ml蒸餾水的250 ml三角瓶里，浸提1 h，離心取上清液，然后用SBA-40E型生物傳感分析儀測(cè)定其中乳酸的含量。

1.5.3 活菌數(shù)的測(cè)定

乳酸菌用MRS固體培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)；大腸桿菌用麥康凱固體培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)Plackeet-Burman實(shí)驗(yàn),從前期單因素發(fā)酵因素中篩選出對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)有重要影響的因素。找出主要因素后，通過設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，使主要因素朝向響應(yīng)值的最大方向變化，逼近最大相應(yīng)區(qū)間[9]。設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，利用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，在一定水平范圍內(nèi)求取最佳發(fā)酵條件。最后對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.7 發(fā)酵溫度的確定

選取溫度為20、30、37、45℃這4個(gè)水平進(jìn)行分析，20℃和30℃發(fā)酵5 d，37℃和45℃發(fā)酵3 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞飼料發(fā)酵條件Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

前期實(shí)驗(yàn)已篩選出肉雞飼料發(fā)酵所用的2株芽孢菌和2株乳酸菌，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)接種量，2株芽孢菌的比例，2株乳酸菌的比例，芽孢菌與乳酸菌的比例，外加水量5個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素高低2個(gè)水平，如表1所示。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及編碼水平

按照上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將發(fā)酵瓶放入37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵3 d后，測(cè)定其還原糖、乳酸、大腸菌數(shù)和乳酸菌數(shù)。如表2所示。以還原糖作為響應(yīng)值，計(jì)算各因素效應(yīng)，如表3。

由表3可以看出，因素A（接種量），因素D（芽胞菌乳酸菌比例），因素E（外加水量）P值均小于0.05，可作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素，其他因素對(duì)結(jié)果影響不大，在進(jìn)一步研究中，其影響效果不進(jìn)行分析。

2.2 肉雞飼料發(fā)酵條件最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接領(lǐng)域才會(huì)近似真實(shí)情形，而在其它區(qū)域擬合方程則幾乎沒有意義，所以要先逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，能快速的逼近最佳區(qū)域。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)已確定三個(gè)因素是關(guān)鍵影響因子，根據(jù)這三個(gè)因素效應(yīng)大小的比例，設(shè)定它們的變化方向以及步長(zhǎng)，其他各因素分別取各自的最優(yōu)水平，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照表4設(shè)計(jì)，將發(fā)酵瓶置于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵3 d后，測(cè)定其還原糖、乳酸、大腸菌數(shù)和乳酸菌數(shù)。如表5所示。

從表5可以看出，5組實(shí)驗(yàn)乳酸含量均在4.0%以上，乳酸菌數(shù)均在109CFU/g以上，而第2組的還原糖含量最高，說明以還原糖作為響應(yīng)值的最優(yōu)點(diǎn)在第2組附近，故以實(shí)驗(yàn)2的條件作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。

2.3 肉雞飼料發(fā)酵條件Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

采用Box-Behnken模型，對(duì)飼料發(fā)酵條件中重要影響因素的水平進(jìn)一步優(yōu)化。以Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)所確定的顯著因素即接種量、芽孢菌與乳酸菌比例、外加水量為自變量，分別以X1、X2、X3來表示，并以1、0、-1代表自變量的高、中、低水平，按公式（1）對(duì)自變量進(jìn)行編碼，Y為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)因素的水平和編碼如表6所示。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及編碼水平

式中：xi為自變量的編碼值；Xi為自變量的真實(shí)值；X0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值；△X為自變量的變化步長(zhǎng)。

按照上述因素設(shè)計(jì)，將發(fā)酵瓶放入37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵3 d后，測(cè)定其還原糖，乳酸，大腸菌數(shù)和乳酸菌數(shù)。如表7所示。

以接種量（X1）、接種比例（X2）和外加水量（X3）為自變量，還原糖含量作為響應(yīng)值(Y)，建立回歸模型。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行二次回歸分析分析，回歸方程為：

表7 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表8 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析

由表8可以看出回歸模型F檢驗(yàn)顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著，其復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=99.14%，表明此模型擬合程度良好，方程應(yīng)變量與全體自變量之間線性關(guān)系明顯。

由響應(yīng)面中各圖素交互作用的立體圖可知，模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)是極大值點(diǎn)，通過嶺脊分析，得到極大值所對(duì)應(yīng)的各主要因素的編碼值（x1、x2、x3）分別為（-0.193 8，0.438 0，0.279 0），從而得到各主要因素（X1、X2、X3）的實(shí)際值為（6.806，2.219，55.395），即接種量6.806% ，接種比例2.219∶1，外加水量55.395%。

2.4 Box-Behnken回歸模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

圖1 接種量和接種比例對(duì)響應(yīng)值影響的響應(yīng)曲面

圖2 接種量和外加水量對(duì)響應(yīng)值影響的響應(yīng)曲面

圖3 接種比例和外加水量對(duì)響應(yīng)值影響的響應(yīng)曲面

響應(yīng)面法得到的最佳條件需進(jìn)一步驗(yàn)證，按照優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即接種量為6.8%，芽孢菌與乳酸菌的比例為2.2∶1，外加水量為55.4%，37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵3 d后，測(cè)定其還原糖，乳酸，大腸菌數(shù)和乳酸菌數(shù)。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果中還原糖平均值為2.32%，與響應(yīng)面理論值2.30%非常接近，這表明實(shí)驗(yàn)值和實(shí)際值之間具有良好的擬合性，從而驗(yàn)證了優(yōu)化模型的有效性。

2.5 發(fā)酵飼料溫度的優(yōu)化

從表10不同發(fā)酵溫度所得的結(jié)果可以看出，20℃和30℃較低溫度下發(fā)酵5 d與較高溫度45℃發(fā)酵3 d基本可以達(dá)到同樣發(fā)酵效果。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，嚴(yán)格控制固態(tài)發(fā)酵溫度難以實(shí)現(xiàn)，一方面嚴(yán)格控制溫度會(huì)增加不必要的成本，另一方面由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生熱量，導(dǎo)致物料堆積中心的溫度與邊緣的溫度差異必然較大。所以通過以上數(shù)據(jù)可以得出在20～45℃均可以，但在實(shí)際生產(chǎn)中控制溫度20～30℃作為發(fā)酵的溫度。

3 結(jié)論

本文利用響應(yīng)面法確定了肉雞飼料的發(fā)酵工藝為接種量為6.8%，芽孢菌與乳酸菌的比例為2.2∶1，外加水量為55.4%，發(fā)酵溫度范圍為20～45℃。按此條件37℃下發(fā)酵72 h后還原糖含量增加了1.97%，是發(fā)酵前的2.97倍，酸溶蛋白質(zhì)含量增加了7.73%，是發(fā)酵前的8.73倍，乳酸含量增加了4.2%，同時(shí)產(chǎn)生了大量益生菌，而且有效的抑制了大腸桿菌。

表9 Box-Behnken回歸模型驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表10 溫度對(duì)發(fā)酵飼料的影響