孫慧莉，武建鳳

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濱州256602)

吲哚-2，3-二酮(ISA)又名靛紅，系天然存在的吲哚類化合物，存在于人體和中藥青黛以及大青葉中，是目前國內(nèi)自行研制開發(fā)的Ⅰ類抗癌新藥靛玉紅化學二聚體結(jié)構(gòu)的單體。該物質(zhì)也存在于龍蝦體內(nèi)，是龍蝦生存所必需的一種天然海洋活性物質(zhì)［1］。研究表明，ISA有促進人和小鼠神經(jīng)母瘤細胞凋亡的作用［2］。2012～2013年，我們觀察了ISA對小鼠骨髓細胞微核和染色體的影響及其安全性?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種小鼠(二級)100只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。ISA(上海宜博生物醫(yī)藥科技有限公司)，秋水仙素(PH0025，Sigma)，甲醇、冰醋酸、KCl溶液均為分析純，小牛血清，Giemsa儲備液，pH6.8的磷酸鹽緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 骨髓細胞微核染毒試驗 隨機取50只小鼠，均分為5組，分別為陽性對照組、陰性對照組及ISA低、中、高劑量組。陽性對照組給予環(huán)磷酰胺0.2 mg/(10 g·d)，陰性對照組給予1 mL/d生理鹽水［3］;ISA 低、中、高劑量組分別給予 ISA 0.2、0.6、1.8 mg/(10 g·d)腹腔注射，連續(xù)4 d，于最后1次注射后24、48、72 h 取樣。

1.2.2 骨髓細胞微核標本制備及分析 采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剪取胸骨，剔去肌肉，用干凈紗布擦拭，剪去每節(jié)骨骺端，用止血鉗擠出骨髓液，點在載玻片一端預先滴好的小牛血清中，混勻后推片。甲醇固定15 min，Giemsa染色15 min，沖洗、晾干。依次經(jīng)低倍鏡、高倍鏡粗檢后，選擇細胞分布均勻、形態(tài)完整、染色良好的區(qū)域鏡檢，然后在油鏡下按一定順序計數(shù)微核，計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞(PCE)中含微核的PCE數(shù)，并計算200個細胞中PCE/正染紅細胞(NCE)值。

1.2.3 骨髓染色體畸變試驗染毒模型和染色體標本的制備 取剩余的50只小鼠，按1.2.1的方法分組并給藥。于實驗第4天給藥6 h后，腹腔注射秋水仙素0.02 mg/10 g，2.5 h后用頸椎脫臼法處死，取出完整股骨并擦凈，7 mL生理鹽水沖洗股骨髓液于離心管中，反復數(shù)次至骨髓發(fā)白，離心棄上清，加入37℃的0.075 mol/L KCl溶液6 mL混合均勻，置37℃恒溫水浴15 min，再加固定液1.5 mL搖勻，離心棄上清，加入新配制固定液5 mL混合，室溫下靜置15 min，離心棄上清。以同樣方法重復固定一次。留約0.5 mL沉淀物，加0.2 mL新固定液混勻，得到細胞懸浮液。取少量細胞懸液滴于玻片上，輕輕吹散并干燥，滴加Giemsa染液染色15 min，純凈水沖洗，晾干。在低倍鏡下按一定順序選擇背景清晰、分散良好、染色收縮適中的中期分裂相細胞，用油鏡進行分析，每個標本觀察80個，分析其染色體結(jié)構(gòu)，確定畸變數(shù)目，計算畸變率。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS11.5統(tǒng)計軟件，結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)的比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間微核形成率比較 不同劑量ISA組的微核形成率與陰性對照組比較均無統(tǒng)計學差異(P均＞0.05)，與陽性對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P均＜0.01)。見表1。

表1 各組微核形成率比較(n=80，±s)

表1 各組微核形成率比較(n=80，±s)

注:與陰性對照組比較，*P＜0.01;與ISA不同劑量組比較，#P＜0.01

組別 微核形成率(%)24 h 48 h 72 h陰性對照組1.7 ±0.5 2.1 ±0.8 2.9 ±0.7陽性對照組 8.3 ±2.1*# 14.5 ±3.0*# 23.0 ±6.0*#ISA 低劑量組 1.8 ±0.8 2.3 ±0.9 3.2 ±1.1 ISA 中劑量組 1.8 ±0.6 2.5 ±0.9 3.7 ±1.2 ISA高劑量組2.2 ±0.9 3.0 ±1.0 3.8 ±1.3

2.2 各組PCE/NCE值及染色體畸變情況比較ISA低、中、高劑量組的PCE/NCE值分別為0.41±0.9、0.38 ±0.8、0.32 ±1.0，陰性對照組為 0.49 ±1.7，陽性對照組為 0.08 ±0.01，ISA 不同劑量組與陰性對照組比較均無統(tǒng)計學差異(P均＞0.05)，與陽性對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P均＜0.01)。油鏡下觀察顯示，環(huán)磷酰胺能誘發(fā)小鼠染色體畸變，表現(xiàn)為斷裂和易位，而陰性對照組和ISA組則少有畸變。各組細胞染色體畸變細胞數(shù)及畸變率比較見表2。

表2 各組細胞染色體畸變情況(n=80)

3 討論

微核試驗是測定細胞遺傳損傷的短期試驗之一［4］。一切進行分裂的細胞，在染色體斷裂劑或能影響紡錘體的毒物作用下均可產(chǎn)生微核，故利用微核試驗可對藥物導致的染色體損傷進行測定。微核可出現(xiàn)在多種細胞中，且在有核細胞中較難與正常核的分支相區(qū)別，由于紅細胞在成熟前最后一次分離后數(shù)小時可將主核排出，而仍保留微核于PCE細胞中，因此，計數(shù)PCE細胞中的微核數(shù)便能檢測因化學毒物或物理因素誘導產(chǎn)生的染色體完整性改變以及檢測染色體分離改變這兩種遺傳學終點［5］。

紅細胞的細胞增殖動力學顯示，其排核成為PCE后，通常在骨髓中停留約2～24 h后入血［6］。由于染毒次數(shù)及取樣時間不同，化學毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)的高峰時間也不盡相同，波動范圍為24～72 h，所以要求在接觸化學毒物后設立不同的采樣時間點。本次微核試驗于不同時間段取樣3次，結(jié)果顯示各組微核形成率均表現(xiàn)為:72 h＞48 h＞24 h，這與微核形成時相變化過程相符。而環(huán)磷酰胺組的微核形成率明顯高于陰性對照組和ISA各劑量組，表明其較強的遺傳毒性作用。ISA高、中、低劑量組的微核率與陰性對照組無統(tǒng)計學差異，同時PCE/NCE值均在正常范圍內(nèi)，提示ISA無毒性。

基因突變和染色體畸變的檢測直接反映了化學毒物的致突變性，是評價化學毒物致突變性唯一可靠的方法［7］。當染色體發(fā)生畸變時，會導致基因在位置及數(shù)量上發(fā)生改變，基因間的平衡性即被打亂［8］。本研究在進行微核試驗的同時，也進行了染色體核型分析，旨在比較兩種試驗結(jié)果的一致性。結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺能誘發(fā)小鼠染色體畸變，表現(xiàn)為斷裂和易位現(xiàn)象，而陰性對照組和ISA組少有畸變，說明環(huán)磷酰胺有致染色體損傷的遺傳效應。環(huán)磷酰胺組畸變率與其他各組比較均有統(tǒng)計學差異，而ISA各劑量組與陰性對照組比較無統(tǒng)計學差異。

ISA對小鼠骨髓細胞微核和染色體的影響少見報道。本研究結(jié)果顯示，ISA無遺傳誘導毒性，為臨床安全用藥提供了參考。

［1］鞠傳霞，侯琳，孫福生，等.2，3-吲哚醌抑制人神經(jīng)母瘤細胞增殖及誘導其凋亡作用的研究［J］.山東醫(yī)藥，2006，46(32):20-21.

［2］宋金蓮，岳旺，侯琳，等.2，3-吲哚醌誘導人神經(jīng)母細胞瘤SHSY5Y細胞凋亡及周期阻滯癌癥［J］.癌癥，2008，27(3):283-288.

［3］馬艷，董碧蓉.中藥誘導小鼠防御素表達［J］.四川醫(yī)學，2009，30(8):1208-1209.

［4］張鐵莉，賈俊芳，盧文卜.3-吲哚羧酸的性質(zhì)對其印跡聚合物印跡效率的影響［J］.分析化學研究報，2010，4(38):593-597.

［5］袁芳，劉映紅，符曉，等.吲哚胺吡咯2，3-雙加氧酶與腎細胞癌預后的預測［J］.中南大學學報，2012，37(7):649-655.

［6］曹佳，林真，余爭平.微核試驗原理、方法及其在人群監(jiān)測和毒性評價中的應用［M］.北京:軍事醫(yī)學出版社，2000:15-60.

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［8］賈慶軍，郭魁亮，劉天鵬，等.環(huán)磷酞胺對小鼠遺傳和生殖毒性影響的研究(1)——對骨髓細胞微核和染色體的影響［J］.白求恩軍醫(yī)學院學報，2006，4(3):6-7.