李瀚旻

湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院肝病研究所(湖北 武漢，430061)

肝臟再生(簡稱肝再生)是一種非常顯著的再生修復反應，可以使肝臟的組織結(jié)構(gòu)和功能得到完全恢復。肝再生的調(diào)控機制極其復雜，其中神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡是其重要環(huán)節(jié)［1，2］。在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡紊亂的狀態(tài)下，正常的肝再生修復反應常被干擾以致出現(xiàn)不完全再生，或難于再生，或再生不足，或無序再生(質(zhì)量表達紊亂、空間分布失衡、時間次序失常)，是肝臟病證發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵共同環(huán)節(jié)，故肝再生調(diào)控成為前景廣闊的防治肝臟病證的策略及方向。

1 肝再生調(diào)控的3 種方式

肝再生過程中細胞與細胞之間相互作用的橋梁主要來自于細胞因子，根據(jù)這些細胞因子對肝再生的正負調(diào)控作用，目前將調(diào)控肝再生的細胞因子主要分為促進肝再生、抑制肝再生和雙向調(diào)節(jié)肝再生的3 大類細胞因子。許多細胞因子(IFN、TGF-β、TNF、白介素等)在調(diào)控肝再生的同時，又影響肝損傷或調(diào)控免疫。目前認為，細胞因子對肝再生的調(diào)控至少存在自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌的3 種方式的調(diào)控機制。早期主要研究自分泌方式的調(diào)控機制，后來發(fā)現(xiàn)旁分泌方式的調(diào)控機制更為廣泛，最近又證實了內(nèi)分泌方式的調(diào)控機制的重要性。在所有的肝再生相關(guān)因子中，最強有力的致分裂增殖因子是肝細胞生長因子(HGF)［3］。Stoker 等首先從培養(yǎng)肝細胞液中，提取到一種有絲分裂原即HGF，具有促進肝細胞再生的作用，并證實HGF 通過肝細胞自分泌產(chǎn)生的方式。后來的研究均證實HGF 是培養(yǎng)肝細胞的強力促分裂增殖劑，HGF 的促肝細胞增殖作用強于EGF 或TGF-α 5～10 倍［4］。肝細胞DNA 合成啟動前數(shù)小時內(nèi)均發(fā)生HGF 受體c-met 的酪氨酸磷酸化，說明HGF 確實參與了促細胞分裂增殖信號的產(chǎn)生。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，旁分泌是調(diào)控肝再生的廣泛方式。調(diào)節(jié)肝臟細胞再生的細胞因子(HGF，TGF-α，TGF-β，等)主要來自于枯否細胞(KC)、星狀細胞(HSC)等肝非實質(zhì)細胞［5］。肝細胞與KC、HSC 在結(jié)構(gòu)上的毗鄰關(guān)系為實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞的互相協(xié)調(diào)、互相影響奠定了形態(tài)學基礎，KC 通過胞質(zhì)突起附著于內(nèi)皮細胞的竇側(cè)或內(nèi)皮細胞之間，有的突起穿過內(nèi)皮細胞間隙或窗孔進入Disse 間隙，從而與肝細胞直接接觸。KC 和HSC 位于肝血竇周圍易與外源性物質(zhì)接觸而活化，產(chǎn)生一系列與肝再生調(diào)控相關(guān)的生物活性物質(zhì)。KC 是肝臟的細胞因子庫，激活后能釋放大量細胞因子和生長因子。HSC 位于竇周隙內(nèi)與內(nèi)皮細胞和肝細胞相鄰，近旁有中間微絲可收縮調(diào)節(jié)和感知血流。

有研究證實，肝外組織(肺、腎、脾，等)亦產(chǎn)生HGF，大鼠PHx (肝部分切除術(shù))后1h，體內(nèi)HGF 血漿水平即已升高，但PHx 后3～6h，Ito 細胞的HGF mRNA 表達開始增加。聯(lián)體動物(血循環(huán)相通)的一只部分肝切除可引起另一只動物肝的增殖［6］。人肝PHx 后HGF 血漿水平持續(xù)升高，且先于肝內(nèi)HGF mRNA 的表達，直到肝臟恢復原體積后下降。HGF 的迅速升高與血源性再生因子出現(xiàn)的時間動態(tài)學相吻合，亦與立即早期基因的迅速變化相吻合，這與HGF 導致某些立即早期基因(LRE-1 和IGFBP1)的表達密切相關(guān)。這些實驗結(jié)果均提示影響肝再生過程的內(nèi)分泌調(diào)控方式。

2 肝內(nèi)微環(huán)境對肝再生的影響

肝再生的啟動是由于肝損傷后肝臟微環(huán)境發(fā)生改變，增強了對即將死亡的受損細胞的清除和對損傷較輕細胞的修復，并通過存活的實質(zhì)或非實質(zhì)細胞增殖及肝內(nèi)外干細胞增殖分化來取代死亡細胞。正常肝臟的成熟肝細胞基本保持不增殖狀態(tài)，但肝損傷微環(huán)境的改變能使成熟肝細胞具有增殖能力的干細胞特性，能很快從基本不生長狀態(tài)進入快速增殖狀態(tài)，故學術(shù)界已將肝細胞劃歸肝干細胞范疇。

肝內(nèi)微環(huán)境主要由肝臟干細胞/祖細胞與肝臟中的基質(zhì)細胞(肝星狀細胞、Kupffer 細胞及竇狀內(nèi)皮細胞)、免疫細胞、胞外基質(zhì)以及神經(jīng)系統(tǒng)所共同構(gòu)成的組織微環(huán)境［7，8］。損傷的肝細胞、枯否細胞和肝星狀細胞均參與炎癥誘導。屬于固有免疫及適應性免疫的炎癥細胞均參與肝損傷和肝再生，肝損傷與肝再生平衡失調(diào)決定肝臟病的發(fā)生與發(fā)展。在肝內(nèi)微環(huán)境中通過細胞接觸，可溶性細胞因子和細胞外基質(zhì)成分以及局部的三維組織結(jié)構(gòu)影響干細胞的活性與功能，通過微環(huán)境的信號調(diào)控干細胞的增殖與分化，對稱與非對稱性分裂，支持干細胞的自我更新，組織器官胚胎發(fā)育和成體再生中的肝組織重構(gòu)，以及生理性應激反應等［9］。包括膠原、非膠原結(jié)構(gòu)糖蛋白、蛋白多糖在內(nèi)的動態(tài)大分子復合物構(gòu)成的肝臟胞外基質(zhì)，在維持肝臟正常結(jié)構(gòu)和細胞的增殖、遷移分化方面發(fā)揮重要作用。完全肝再生需要重新合成以前降解的胞外基質(zhì)，內(nèi)皮細胞需要與胞外基質(zhì)接觸來抑制接觸誘導的凋亡。肝臟胞外基質(zhì)還參與了新生肝細胞結(jié)節(jié)的竇狀隙形成，竇狀隙周圍胞外基質(zhì)的重建能穩(wěn)定新產(chǎn)生的肝細胞［10～12］。

肝星狀細胞作為肝臟中的基質(zhì)細胞的成分之一，不僅在肝纖維化中扮演了重要角色，而且作為干細胞龕的組成部分在肝再生過程中也發(fā)揮了重要作用［13］。它通過細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生與重建、細胞因子的產(chǎn)生以及竇孔的改變來調(diào)節(jié)肝再生的過程，在肝臟中執(zhí)行重要的生理功能。近些年來，有研究表明，肝星狀細胞還具有多向分化潛能，在一定條件下可分化為肝細胞及血管內(nèi)皮細胞，可直接參與肝損傷修復的細胞再生［14］。

3 肝外大環(huán)境對肝再生的影響

越來越多的臨床觀察和實驗研究表明，肝再生過程并不僅僅是肝臟局部孤立的病理生理過程(肝內(nèi)微環(huán)境對肝再生的影響)，而是整體調(diào)節(jié)的綜合結(jié)果，其中包括肝外大環(huán)境對肝再生的影響和肝外大環(huán)境與肝內(nèi)微環(huán)境相互作用的影響機制。最初發(fā)現(xiàn)肝外大環(huán)境對肝再生顯著影響的事實是再生肝的體積變化隨個體的大小而出現(xiàn)精確的適應性變化，有學者將一條大狗的肝臟移植到小狗的體內(nèi)，被移植肝臟逐漸變小，直到與小狗較小的個體相協(xié)調(diào)［15］。將狒狒的肝臟移植到人的體內(nèi)，肝臟會在一周左右增加重量和體積，直到適合較大的人體［16］。后來，有研究證實，在部分肝切除后期，細胞因子的肝外表達增加，如白色脂肪組織［17］，可以在肝損傷后導致全身性的細胞因子反應。IL-6 缺失受者的骨髓移植實驗結(jié)果表明，骨髓來源的細胞是肝再生過程中IL-6 的另一細胞來源［18］。起源于肝內(nèi)的損傷相關(guān)信號可以促進肝外組織釋放活性因子(如生長調(diào)控激素、神經(jīng)遞質(zhì)、有絲分裂原、細胞因子)，以增強肝臟局部再生修復效果。

研究自分泌、旁分泌對肝再生的調(diào)控機制主要揭示肝內(nèi)微環(huán)境對肝再生的影響，研究內(nèi)分泌對肝再生的調(diào)控機制可以從一個側(cè)面揭示肝外大環(huán)境對肝再生的影響。內(nèi)分泌受高級神經(jīng)中樞調(diào)控，下丘腦是調(diào)節(jié)內(nèi)分泌活動的中心環(huán)節(jié)，在下丘腦-垂體-性腺軸、下丘腦-垂體-胸腺軸、下丘腦-垂體-甲狀腺軸、下丘腦-垂體-腎上腺軸廣泛而深入研究的基礎上，近幾十年來，國內(nèi)外學者已開始注重研究肝臟與高級神經(jīng)中樞的關(guān)系。1982年在意大利Serono 召開的首屆“內(nèi)分泌與肝臟”專題討論會提出了下丘腦-垂體-肝軸的新概念，并把肝臟視為是使激素和其他細胞調(diào)節(jié)因子協(xié)調(diào)統(tǒng)一的一個重要部位［19］。肝再生與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡相互影響的結(jié)構(gòu)功能系統(tǒng)構(gòu)成了神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡。

早有研究證實，激素類(胰島素、胰島素樣生長因子、胰高血糖素、甲狀腺素、腎上腺素、去甲腎上腺素、瘦素等)對肝再生具有明確的調(diào)節(jié)作用，通過“二離子信號系統(tǒng)”可能是其作用機制之一。第一離子信號系統(tǒng)是通過調(diào)節(jié)單價陽離子(特別是Na+、K+)的流入而激活細胞膜系統(tǒng)。Na+迅速流入以交換H+，增強Na+-K+-ATP 酶活性，促進氨基酸轉(zhuǎn)運、RNA 及蛋白質(zhì)合成。第二離子信號系統(tǒng)是通過Ca++流入cAMP 電涌改變，提高胞漿cAMP 水平和DNA 合成率。肝臟切除后的應激反應通過下丘腦-垂體-靶腺軸促使甲狀腺、胰腺和腎上腺分泌甲狀腺素、胰島素和腎上腺素以適應肝再生修復的需要［20］。

為深入研究神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡對肝再生的影響及機制，我們創(chuàng)建了MSG-肝再生-大鼠模型。左旋谷氨酸單鈉 (Monosodium L-Glutamate，MSG)是一種神經(jīng)毒素，大鼠出生后2、4、6、8、10d 皮下給予MSG，可選擇性地破壞下丘腦弓狀核(arcuate nucleus，ARN)，進而引起復雜的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能紊亂，其下丘腦-垂體-靶腺軸的功能異常尤其突出。下丘腦-垂體-腎上腺軸功能呈病理性亢進，其可能機理為ARN 投射到室旁核(PVN)的抑制性纖維消失;下丘腦-垂體-性腺軸功能明顯低下，機制可能為ARN 中黃體激素釋放激素(LHRH)神經(jīng)元破壞，LHRH 分泌減少及垂體對LHRH 的反應性減低，從而性腺的發(fā)育受到影響;下丘腦-垂體-甲狀腺功能改變則有亢進和低下的不同報道。神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)存在密切聯(lián)系，MSG-大鼠的細胞免疫功能顯著受抑。MSG-肝再生-大鼠模型的創(chuàng)建為探討病理狀態(tài)(神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡功能紊亂)下的肝再生機制和藥物篩選奠定了堅實的實驗基礎。實驗結(jié)果表明，MSG-肝再生-大鼠模型肝再生過程嚴重失調(diào)，表現(xiàn)為初期(術(shù)后24h 以前)肝再生較快，中晚期肝再生過程則受到顯著抑制，最終在肝再生度、肝細胞分裂指數(shù)和肝重/體重比值等方面均不能恢復到正常水平。提示MSG-肝再生-大鼠的肝再生過程受到肝外大環(huán)境的影響，包括高級神經(jīng)中樞的調(diào)控，其調(diào)控的可能機制是通過下丘腦-垂體-肝軸與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡影響模型大鼠的肝再生過程［21］。

4 肝內(nèi)外環(huán)境對肝再生的相互影響機制

有學者總結(jié)分析肝內(nèi)外HGF 的作用，認為HGF存在血源性肝細胞生長因子(HGF-h)和胞源性肝細胞生長因子(HGF-c)兩種形式。HGF-h 作為早期信號，啟動肝細胞分裂;而HGF-c 僅作用于感受態(tài)肝細胞，促進其分裂。正常情況下，肝臟可清除血循環(huán)中過量的HGF-h，使血漿中HGF-h 的含量維持在一定水平。當肝大部切除術(shù)后，由于大塊的肝組織突然丟失 (肝臟清除HGF-h 的能力減弱或喪失)，使HGF 不能及時清除，從而血循環(huán)中出現(xiàn)高水平的HGF，導致血漿中HGF-h 的含量上升，通過內(nèi)分泌方式使肝再生得以啟動和進行。此后，肝臟內(nèi)HGF-c開始產(chǎn)生，繼續(xù)促進肝細胞分裂。隨著肝再生的進行，重構(gòu)的肝組織逐漸恢復清除HGF-h 的能力，血漿中HGF-h 的含量又很快恢復到正常水平，從而減輕、消除對肝外器官的影響。

我們在研究MSG-肝再生-大鼠肝內(nèi)外環(huán)境對肝再生的相互影響機制后發(fā)現(xiàn)，MSG-肝再生-大鼠肝再生和下丘腦TGF-α、EGFR、TGF-β、TGF-βRⅠ、Ⅱ的基因表達失調(diào)，不僅表現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平上，而且在表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上;不僅表現(xiàn)在空間上，而且表現(xiàn)在時間上;不僅表現(xiàn)在數(shù)量上，而且表現(xiàn)在質(zhì)量上。MSG-肝再生-大鼠肝內(nèi)外調(diào)控肝再生的基因表達失調(diào)的結(jié)果不僅最終表現(xiàn)為肝再生過程嚴重失常，而且能導致神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡的進一步紊亂［22～25］。

5 中藥對神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡的作用

中藥廣泛用于急慢性肝病的治療，其有效的作用機制可能是多途徑、多層次、多系統(tǒng)、多靶點、多時限地調(diào)控肝再生過程，通過影響神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡可能是其重要環(huán)節(jié)，很值得系統(tǒng)深入地研究。為探討左歸丸通過影響神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡治療肝臟病的作用及其機制，我們采用免疫組織化學方法觀察左歸丸影響MSG-肝再生-大鼠再生肝和ARN 的TGF-α、β 及其受體的表達;Dig 標記探針原位雜交法檢測MSG-肝再生-大鼠再生肝和ARN的TGF-α、TGF-β1mRNA;RT-PCR 加Dot Blot 法定量檢測MSG-肝再生-大鼠再生肝TGF-β1mRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSG-肝再生-大鼠與正常大鼠肝再生模型比較，其再生肝和ARN 中的TGF-α、TGF-αmRNA 和EGFR 表達顯著下調(diào)，TGF-β1、TGF-β1mRNA、TGFβRⅠ和RⅡ表達顯著上調(diào)，左歸丸能顯著上調(diào)MSG-肝再生-大鼠再生肝和 ARN 中的 TGF-α、TGFαmRNA 和 EGFR 的 表 達 和 下 調(diào) TGF-β1、TGFβ1mRNA、TGF-βRⅠ和RⅡ的表達。提示左歸丸可通過影響神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡在一定程度上改善MSG-肝再生-大鼠的肝再生過程［26～29］。為研究地五養(yǎng)肝膠囊(鄂藥制字Z20113160)對MSG-肝再生-大鼠肝再生的影響及機制，采用復制MSG-肝再生-大鼠模型，觀察地五養(yǎng)肝膠囊對其肝再生紊亂的調(diào)控作用，免疫組織化學法檢測肝組織和垂體纖維粘連蛋白FN 的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地五養(yǎng)肝膠囊能在一定程度上改善MSG-肝再生-大鼠的肝再生紊亂過程，其作用機制之一可能是通過下丘腦-垂體-肝軸影響神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-肝再生調(diào)控網(wǎng)絡改善了肝內(nèi)外肝再生修復的環(huán)境［30～32］。

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