吳玉江，富國文，益西多吉，王紹卿，張念偉，滕曉紅，索朗達(dá)，巴 貴，次仁德吉，樊月圓＊

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩850009；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

西藏絨山羊是我國養(yǎng)殖歷史較為悠久的一種絨山羊，主要分布的克什米爾絨山羊?qū)賴抑攸c(diǎn)保護(hù)品種之一，有高原型和山谷型之分，廣泛分布在西藏西北部廣袤的羌塘草原，其中阿里、那曲地區(qū)的白絨山羊是西藏絨山羊的典型代表［1］，其羊絨品質(zhì)居世界羊絨之首［2］。羊毛纖維的品質(zhì)直接影響了羊絨的價(jià)格，其中絨纖維細(xì)度是影響價(jià)格的最主要因素。除此之外長度、顏色、光澤度和拉力強(qiáng)度等也是衡量羊絨品質(zhì)的重要指標(biāo)。這些性狀是非遺傳因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，它不僅受基因水平上的影響，而且生理狀態(tài)、年齡、營養(yǎng)和氣候等對(duì)其也有影響［3，4］。角蛋白（Keration）和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（keratin associated proteins，KAPs）是羊絨的主要結(jié)構(gòu)蛋白，國內(nèi)外大量研究表明，羊絨的角蛋白組成與其纖維的品質(zhì)有密切關(guān)系，并受遺傳、營養(yǎng)、生理和環(huán)境等因素的影響而發(fā)生變化［5－9］。KAPs是動(dòng)物毛發(fā)的結(jié)構(gòu)蛋白之一，根據(jù)其氨基的Cys含量，KAP蛋白被分為3類，分別為高硫家族（Cys＜30%）、超高硫家族（Cys＞30%）和富含Gly－Tyr家族［10－11］。目前大量研究表明，KAP基因的遺傳差異可能在決定不同毛品質(zhì)和產(chǎn)量等性狀方面發(fā)揮重要的作用［12－17］。

本文采用PCR－SSCP 技術(shù)，以KAP6.3作為候選基因，對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行了分析，旨在探索KAP6.3基因多態(tài)性對(duì)西藏絨山羊生產(chǎn)性狀的影響，為闡明西藏絨山羊品種特點(diǎn)及選種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集西藏自治區(qū)曲尼帕試驗(yàn)站144只周歲西藏絨山羊耳組織樣本，公母各半，放入無水乙醇于－20℃保存?zhèn)溆?。產(chǎn)絨前體重、體高、體長、胸圍、胸深、十字部高、絨長、毛長以及產(chǎn)絨量等數(shù)據(jù)，由曲尼帕試驗(yàn)站提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耳組織樣基因組DNA 提取 取15mg 左右耳組織，讓其表面酒精揮發(fā)后，用剪刀盡可能地將其剪成碎末，轉(zhuǎn)入1.5mL 離心管，參照DNA 提取試劑盒（TaKaRa）說明書進(jìn)行提取。提取的基因組DNA 通過核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度，0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物信息 參照GenBank 提供的山羊KAP6.3基因序列（登錄號(hào)：AY310751）及劉海英（2007）［15設(shè)計(jì)的引物。上游引物為：5＇－GCTATGGAGGCCTGGGCTG－3＇，下 游 引 物 為：5＇－GGAAAATTGGAGGGTGAGAGTCTTC－3＇，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為199bp。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其Tm 值為62.5 ℃。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系：10×Premix taq 12.5μL，模板DNA 1μL（50ng／μL），上游引物0.5 μL（10pmol／μL），下游引物0.5μL（10pmol／μL），ddH2O10.5μL，共計(jì)25μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5min；30個(gè)循環(huán)（94℃30s，62.5℃40s，72℃1min）；72℃延伸10min，4℃保存。

1.2.4 PCR－SSCP分析與測(cè)序 用14%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳前120V 預(yù)電泳30 min。4 μL PCR 產(chǎn)物和8μL的變性buffer（95%去離子甲酰胺、1 mmol EDTA （pH＝8.0）、0.025%二甲苯菁、0.025%溴酚藍(lán)、10%甘油），98 ℃變性10min，取出迅速置于準(zhǔn)備好的碎冰中，使之保持單鏈狀態(tài)，10min后全部上到14%聚丙烯酰胺凝膠（Acr：Bis＝29：1）中電泳。200V 高壓電泳30min，然后110 V 電泳20h左右；電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯帶并用紫外凝膠成像系統(tǒng)照相分型。選取不同基因型個(gè)體的DNA 樣品進(jìn)行克隆，測(cè)序由上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)不同基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。運(yùn)用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)最小二乘線性模型，分析KAP6.3基因的性別因素和基因型因素的交互效應(yīng)，采用了以下固定模型：Yijl＝μ＋αi＋βj＋eijl。式中：Yijl為個(gè)體表型記錄，μ為試驗(yàn)全部觀測(cè)值總體平均值，αi為性別效應(yīng)，βj為基因型效應(yīng)，eijl為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 產(chǎn)物和PCR－SSCP檢測(cè)結(jié)果

PCR 擴(kuò)增結(jié)果見圖1，擴(kuò)增片段長度為199bp；用14%聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)其SNPs，其檢測(cè)結(jié)果共發(fā)現(xiàn)5種基因型，分別命名為基因型1、基因型2、基因型3、基因型4和基因型5，PCR－SSCP 電泳結(jié)果見圖2。

圖1 KAP6.3基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物1－6為擴(kuò)增產(chǎn)物；M.DL 1000Fig.1 Amplified products of KAP6.3gene.1－6were amplified products；M was DL1000

圖2 KAP6.3基因的PCR－SSCP檢測(cè)結(jié)果1－5為KPA6.3基因的5種基因型Fig.2 PCR－SSCP Test of KAP6.3gene1－5marked different genotypes of KAP6.3gene

2.2 KAP6.3基因擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析

克隆測(cè)序結(jié)果與 GenBank （序列號(hào)：AY310751）中的序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段內(nèi)存在7 個(gè)SNPs，分別位于C134T、G148A、G170A、T210C、A217G、A229C 和T284G 處，其中T284G存在于該基因的3＇－UTR 端。PCR－SSCP 和測(cè)序結(jié)果結(jié)合分析，分型如下：C－N－N－T－A－A－N 連鎖突變命名為基因型1；C－N－G－T－N－A－T 連鎖突變命名為基因型2；C－N－N－T－A－N－T連鎖突變命名為基因型3；N－N－N－T－A－A－T連鎖突變命名為基因型4；C－NN－N－A－A－T連鎖突變命名為基因型5。各基因型序列比較結(jié)果如下：

圖3 5種基因型的核甘酸序列與GenBank上的序列的BLAST結(jié)果Fig.3 BLAST result of nucleotide sequences of 5genotypes in GenBank

2.3 KAP6.3基因編碼區(qū)氨基酸變化

利用DNAman軟件對(duì)7個(gè)SNPs 造成的氨基酸變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共存在2個(gè)同義突變和4個(gè)錯(cuò)義突變，4處錯(cuò)義突變分別為148位點(diǎn)TGC（Cys半胱氨酸）→TAC（Tyr酪氨酸）；210位點(diǎn)TCT（Ser絲氨酸）→CCT（Pro 脯氨酸）；217位點(diǎn)TAT（Tyr酪氨酸）→TGT（Cys 半胱氨酸）和229 位點(diǎn)TAT（Tyr酪氨酸）→TCT（Ser絲氨酸）。具體于各基因型中的分布如圖4，比較發(fā)現(xiàn)5種基因型都在第30位發(fā)生了氨基酸Cys→Tyr的錯(cuò)義突變；基因型2的53位的氨基酸由Tyr轉(zhuǎn)變?yōu)镃ys；基因型3的57位的氨基酸由Tyr轉(zhuǎn)變?yōu)镾er；基因型5的51位的氨基酸由Ser轉(zhuǎn)變?yōu)镻ro。

圖4 5種基因型對(duì)應(yīng)氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果Fig.4 Comparison of amino acid sequence of 5genotypes

2.4 西藏絨山羊KAP6.3基因的基因型頻率

根據(jù)聚丙烯酰胺膠圖對(duì)應(yīng)測(cè)序結(jié)果對(duì)所有試驗(yàn)個(gè)體進(jìn)行分型，統(tǒng)計(jì)各基因型頻率，結(jié)果如表1 所示。檢測(cè)到的5種基因型中，基因型2在群體中的頻率最高（50%），基因型1次之，這兩種基因型是群體的優(yōu)勢(shì)基因型，占群體頻率的89%；基因型3～5在群體中個(gè)體較少，其頻率在3%～6%范圍。

表1 西藏絨山羊KAP6.3 基因的基因型頻率分布Table 1 Genotypes frequency of KAP6.3gene in Tibetan Cashmere goats

2.5 西藏絨山羊KAP6.3基因多態(tài)性與生產(chǎn)性狀的相關(guān)性分析結(jié)果

考慮到基因型3、基因型4和基因型5在群體中所占比例不足10%，本研究只將基因型1和基因型2與生產(chǎn)性狀做了相關(guān)性分析。在由表2可見，從基因型考慮，在體重指標(biāo)方面，周歲西藏絨山羊母羊的基因型1 個(gè)體顯著高于基因型2 個(gè)體（P＜0.05）；從性別因素考慮，在體尺性狀方面，母羊在體高指標(biāo)方面顯著優(yōu)于公羊（P＜0.05），在十字部高指標(biāo)方面極顯著優(yōu)于公羊（P＜0.01）；而在產(chǎn)絨性狀方面，公羊個(gè)體在毛長指標(biāo)方面極顯著優(yōu)于母羊（P＜0.01），產(chǎn)絨量也顯著高于母羊（P＜0.05）；而基因型和性別的互作沒有對(duì)生產(chǎn)性狀產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

3.1 KAP 家族基因多態(tài)性與產(chǎn)絨性狀的相關(guān)性

KAPs是編碼毛發(fā)纖維組成蛋白的一種結(jié)構(gòu)基因，由多基因家族編碼。目前在綿羊和山羊上報(bào)道有KAP1、KAP6、KAP8、KAP9、KAP13基因與羊毛的質(zhì)量和產(chǎn)量的相關(guān)性研究。劉桂芬等［12］對(duì)高硫蛋白基因（KAP1.1、KAP1.3）的多態(tài)位點(diǎn)W08667與羊毛細(xì)度的相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)對(duì)新疆優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊的羊毛細(xì)度有顯著影響（P＜0.05）；Itenge－Mweza等［13］研究發(fā)現(xiàn)KAP1.1基因在美利奴綿羊中存在多態(tài)性，且與羊毛的細(xì)度有顯著的相關(guān)性；王杰等［14］利用PCR－SSCP方法對(duì)高原型藏山羊的KAP6.1和KAP6.2基因進(jìn)行判型，并對(duì)各個(gè)基因型與產(chǎn)絨量、絨長度和細(xì)度的相關(guān)性進(jìn)行分析；劉海英［15］在KAP6.3基因的編碼區(qū)和3＇－非翻譯區(qū)共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中AB 基因型產(chǎn)絨量顯著高于其它基因型；F 和H 基因型的產(chǎn)絨量最高，且絨長度最長；AC 基因型的絨纖維細(xì)度最??；KAP8.1和KAP8.2基因的多態(tài)性研究見于趙俊星等［16］和劉海英等［15］，共有4 個(gè)SNPs被發(fā)現(xiàn)；研究發(fā)現(xiàn)KAP13－1基因也存在豐富的多態(tài)性。綜上所述，KAP基因雖然具有較大的基因變異，但并未導(dǎo)致動(dòng)物的致死，只是改變了毛發(fā)的特征如產(chǎn)絨量、絨的細(xì)度和長度等，因此這些變異才得以遺傳保留。這也使得在KAP基因家族尋找影響產(chǎn)絨性狀的有效QTL成為可能。

3.2 KAP6.3基因的多態(tài)性以及與生產(chǎn)性狀的關(guān)系

本次試驗(yàn)采用PCR－SSCP技術(shù)及DNA 克隆測(cè)序方法對(duì)西藏絨山羊KAP6.3基因的編碼區(qū)和部分3＇－UTR區(qū)（199bp）進(jìn)行多態(tài)性研究，顯示為5種基因型，經(jīng)測(cè)序共發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNPs，與劉海英［15］在內(nèi)蒙古絨山羊上檢測(cè)到的SNPs有4 處相同，分別為C134T、G170A、A217G 和A229C，C149T 和G163A處的突變是在內(nèi)蒙古絨山羊上檢測(cè)得到，而G148A、T210C 和T284G 突變是在西藏絨山羊上檢測(cè)得到的。由此可見，KAP6.3基因保守性較差，從而具有豐富的遺傳變異，但由于研究群體所處的地理環(huán)境及氣候條件的影響，不同種群變異位置存在較大差異。同時(shí)對(duì)7個(gè)SNPs所導(dǎo)致的氨基酸的變化進(jìn)行比對(duì)，共存著4處錯(cuò)義突變，分別為30位Cys→Tyr、51位Ser→Pro、53位Tyr→Cys、57 位Tyr→Ser。其中217位和229位氨基酸變化與劉海英研究一致。氨基酸的改變可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的構(gòu)型和表達(dá)，從而影響動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)性狀。因此本研究又將優(yōu)勢(shì)基因型1和基因型2對(duì)西藏絨山羊生產(chǎn)性狀的影響做了相關(guān)性分析。分析結(jié)果顯示，周歲母羊在體尺指標(biāo)如體高、十字部高方面顯著高于公羊，而周歲公羊在毛長和產(chǎn)絨量方面明顯優(yōu)于母羊（P＜0.05）。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，其它體尺指標(biāo)，如體重、體長、胸圍、胸深，母羊都高于公羊；而測(cè)定的三個(gè)產(chǎn)絨性狀指標(biāo)－絨長，毛長，產(chǎn)絨量，公羊卻高于母羊。因此，分析產(chǎn)絨指標(biāo)不僅跟動(dòng)物皮膚面積的大小有關(guān)，而單位面積皮膚的絨密度可能才是決定產(chǎn)絨量的主要因素。

表2 基因型和性別對(duì)西藏絨山羊生產(chǎn)性狀的方差分析Table 2 ANOVA between genotypes and sex and production traits in Tibetan Cashmere Goats

4 結(jié)論

KAP6.3基因在西藏絨山羊群體中存在較大的遺傳變異，這些變異與羊的生產(chǎn)性狀指標(biāo)密切相關(guān)，可將其作為影響西藏絨山羊生長性狀和產(chǎn)絨性狀的候選基因，用于其具高產(chǎn)品系選育的輔助分子標(biāo)記。

［1］高雪峰，邢玉梅.我國絨山羊品種資源現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策［J］.中國草食動(dòng)物，2011，31（6）：50－53.

［2］Gillespie J M，F(xiàn)renkel M J.The tyrosine－rich proteins of keratins.Occurrence，properties and regulation of biosynthesis［C］.Proceedings of the 5th International Wool Textile Research Conference，1975，Aachen，1976：265－276.

［3］Gillespie J M，Marshall R C.Variability in the proteins of wool and hair［C］.Proceedings of the 6thInternational Wool Textile Research Conference 1980Pretoria，1980：67－77.

［4］周旭英，邱建軍，孔學(xué)民.西藏白絨山羊產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與未來發(fā)展［J］.當(dāng)代畜牧，2003（9）：1－3.

［5］彭玉麟，賈志海，盧德勛，等.不同蛋白質(zhì)水平的日糧對(duì)內(nèi)蒙古白絨山羊消化代謝的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，33（4）：321－326.

［6］Zhou H M，Allain D，Li J Q，et al.Effects of non－genetic factors on production traits of Inner Mongolia cashmere goats in China［J］.Small Rumin Res，2003，47：85－89.

［7］王林楓，盧德勛，孫海州，等.光照和埋植褪黑激素對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊氮分配和生產(chǎn)性能影響的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，11（1）：22－28.

［8］牛一兵，賈志海，盧德勛，等.放牧條件下絨山羊絨毛季節(jié)性生長變化規(guī)律的研究［J］.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2005，17（2）：33－37.

［9］Bai J Y，Zhang Q，Li J Q，et al.Estimates of genetic parameters and genetic trends for production traits ofInner Mongolian White Cashmere goat［J］.Asian－Aust J Anim Sci，2006，19（1）：13－18.

［10］Rogers M A，Langbein L，Winter H，et al.Hair keratin associated proteins：characterization of a second high sulfur KAP gene domain on human chromosome 21［J］.J Invest Dermatol，2004，122：147－158.

［11］Rogers M A，Langbein L，Winter H，et al.Characterization of a cluster of human high／ultrahigh sulfur keratin－associated protein genes embedded in the type I keratin gene domain on chromosome 17ql2－21［J］.J Biol Chem，2001，276：19 440－19 451.

［12］劉桂芬，田可川，張恩平，等.優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊羊毛細(xì)度的候選基因分析［J］.遺傳，2007，29（1）：70－74.

［13］Itenge－mweza T O，F(xiàn)orrest R H J.Polymorphism of the KAP1.1，KAP1.3and K33genes in Merino sheep［J］.Mol Cellular Probes，2007，21：338－342.

［14］王 杰，代怡倩，王 永，等.高原型藏山羊KAP6.1 和KAP6.2位點(diǎn)與產(chǎn)絨性狀的關(guān)系研究［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，36（6）：962－966.

［15］劉海英.KAP8、KAP6.3和FGF5基因變異對(duì)絨毛性狀的影響及絨毛品質(zhì)變化規(guī)律的研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［16］趙俊星，任有蛇，岳文斌.三個(gè)山羊品種KAP8基因的PCRSSCP分析［J］.生物技術(shù)，2007，17（5）：3－5.

［17］李明娜，劉 秀，王繼卿，等.4個(gè)絨山羊群體KAP13－1基因的遺傳多態(tài)性分析［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，41（4）：7－15.