胡 源，曾文先

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

長鏈非編碼RNA（lncRNA）具有在細(xì)胞特異性表達(dá)的特性［1］，參與形成細(xì)胞核中的亞結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動和生物學(xué)過程，包括調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的活性、干細(xì)胞自我更新與分化等［2］。但關(guān)于lncRNA 在小鼠精子發(fā)生過程中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)理目前尚未見報道。lncRNA NEAT1作為核心組分參與形成旁斑（paraspeckle）結(jié)構(gòu)［3］。敲除NEAT1影響DBHS（Drosophila melanogaster behavior，human splicing）蛋白在細(xì)胞中的定位，從而影響旁斑結(jié)構(gòu)的形成［4－5］。而旁斑可以阻滯成熟mRNA 的出核與后續(xù)翻譯［6］，參與調(diào)控細(xì)胞的分化和生長［7，8］。在細(xì)胞分化的過程中NEAT1的表達(dá)升高［9－11］。本研究旨在探索NEAT1對維持小鼠精子發(fā)生所起的作用，為雄性動物的精子發(fā)生過程和生殖研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及細(xì)胞系

試驗(yàn)動物：C57BL／6J小鼠，昆明種小白鼠。細(xì)胞系：GC－1精原細(xì)胞系，293T 細(xì)胞系。病毒包裝系統(tǒng)：CD513B－U6表達(dá)質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒（pVSV－G、pGag－Pol、pRsv－rev）。

1.2 主要試劑與儀器

PCR 擴(kuò)增儀；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（Biorad）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）；超凈工作臺（蘇州）；臺式低溫離心機(jī)（Sigma）；超純水制備系統(tǒng)（Mill－Q）；立式壓力蒸汽滅菌鍋；熒光倒置顯微鏡（Olympus），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）。

1.3 NEAT1表達(dá)檢測

RNA 提取：使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA；反轉(zhuǎn)錄PCR：使用TaKaRa 公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒；PCR：使用TaKaRa公司Ex Taq?試劑盒，引物信息如下：

上游引物：TACATGGGGGCAGTGTCCTA

下游引物：ACCACAGAAGAGGAAGCACG

1.4 干擾載體構(gòu)建

包括設(shè)計shRNA；CD513B－U6質(zhì)粒雙酶切：使用BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切；構(gòu)建CD513B－U6－shRNA 載體及測序。

表1 NEAT1的shRNA 序列信息Table 1 The shRNA sequence information of NEAT1

1.5 慢病毒包裝與滴度測定

使用 CD513B－U6－shRNA 載體、pVSV－G1、pGag－Pol、pRev ug包裝載體，轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞系進(jìn)行病毒包裝；采用倍比稀釋法測定慢病毒的滴度，用熒光顯微鏡觀察每孔中發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)量，對最后兩個有綠色熒光細(xì)胞的孔進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，數(shù)目依次記為X，Y，公式為：

滴度（TU／mL）＝（X＋Y×10）×1000／2X 孔的病毒溶液的含量（μL）。

1.6 有精子發(fā)生的曲細(xì)精管比例統(tǒng)計

使用多聚甲醛固定小鼠的睪丸，石蠟包埋切片后進(jìn)行 H.＆E.染色。依據(jù)Kanatsu－Shinohara等［12］采用的方法，當(dāng)生殖細(xì)胞在曲細(xì)精管的管基底膜呈圓周狀分布，并且生殖細(xì)胞有兩層或者兩層以上時，判定該曲細(xì)精管有精子發(fā)生；曲細(xì)精管內(nèi)生殖細(xì)胞沒有達(dá)到兩層的，則判定為無精子發(fā)生。精子發(fā)生比例：有精子發(fā)生精細(xì)管占總體曲細(xì)精管的比例。每個處理組設(shè)置三個重復(fù)，每個重復(fù)觀察平均約50個曲細(xì)精管。

2 結(jié)果與分析

2.1 NEAT1在小鼠睪丸及細(xì)胞系中的表達(dá)

提取C57BL／6J小鼠的睪丸組織和GC－1細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR 后用cDNA 模板進(jìn)行PCR 檢測NEAT1的表達(dá)分布，結(jié)果表明NEAT1 在成年小鼠睪丸以及GC－1細(xì)胞系中均表達(dá)（圖1）。

圖1 NEAT1在睪丸組織和GC－1細(xì)胞中的表達(dá)A.提取的RNA 電泳圖片；B.RT－PCR 結(jié)果；1.GC－1細(xì)胞系；2.睪丸組織Fig.1 NEAT1expression in testicular tissue and GC－1cellsA.Bxtracted RNA electrophoresis；B.RT－PCR resuts；1.GC－1cells；2.Testicular tissues

2.2 干擾載體構(gòu)建結(jié)果與分析

將干擾shRNA 和雙酶切后的CD513B－U6 載體連接構(gòu)建干擾載體。質(zhì)粒送公司測序，將結(jié)果和設(shè)計的shRNA 進(jìn)行比對，連接成功且未出現(xiàn)堿基突變（圖2），表明NEAT1干擾載體構(gòu)建成功。

2.3 慢病毒包裝及病毒滴度測定

利用SBI的第三代慢病毒包裝系統(tǒng)，將四個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系包裝病毒，16h后進(jìn)行觀察并換成病毒包裝緩沖液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有約70%的293T 細(xì)胞能夠自發(fā)熒光，表明轉(zhuǎn)染成功（圖3）。48h后收毒，并進(jìn)行滴度測定，測定結(jié)果為1.72×107TU／mL。

圖2 測序結(jié)果分析Fig.2 The analysis of sequencing results

2.4 干擾效果檢測結(jié)果及分析

將構(gòu)建的慢病毒感染GC－1 細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)病毒感染細(xì)胞效果良好（圖4）。

提取GC－1細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR 后實(shí)時定量PCR 檢測NEAT1的表達(dá)，結(jié)果顯示包裝的干擾慢病毒能夠?qū)EAT1轉(zhuǎn)錄本水平下調(diào)69%，干擾效果良好（圖4）。

圖3 四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，16h后熒光圖左側(cè)為NEAT1－shRNA 組，右側(cè)為NC組Fig.3 The Fluorescent images at 16hours after the transfection of four plasmids into 293Tcell lineLeft means CD513B－U6－NEAT1－shRNA，Right means CD513B－U6－NC

圖4 慢病毒感染GC－1細(xì)胞效果A，B，C分別為明場圖，熒光圖和疊加圖Fig.4 The efficiency of lentivirus infect GC－1cellsA，B，C are BFI，fluorography and overlay chart

圖5 在GC－1細(xì)胞中檢測RNAi干擾效果Fig.5 RNA interference of NEAT1in GC－1cells

2.5 睪丸指數(shù)檢測結(jié)果及分析

統(tǒng)計并對比干擾組，NC 組和空白組（未注射病毒）小鼠睪丸指數(shù)，結(jié)果顯示干擾病毒注射組睪丸指數(shù)大于另外兩組，表明睪丸的重量有輕微增加的趨勢，但統(tǒng)計結(jié)果不顯著（P＝0.11）（圖6）。

2.6 NEAT1干擾病毒注射對精子發(fā)生的影響

將干擾和NC組病毒通過睪丸輸出管注射到曲細(xì)精管中，35d后固定干擾病毒注射組和NC 組小鼠睪丸組織并進(jìn)行H.＆E.染色。對比不同組的H＆E 染色圖發(fā)現(xiàn)注射NEAT1 干擾病毒后小鼠（相對于NC 組）睪丸中有精子發(fā)生的曲細(xì)精管減少，部分管腔內(nèi)生殖細(xì)胞變少，表明干擾NEAT1可能影響小鼠精子發(fā)生（圖7）。

圖6 干擾組、空白組和對照組的睪丸指數(shù)Fig.6 The ratio of testicles in interfering group，blank group and control group

2.7 有精子發(fā)生的曲細(xì)精管統(tǒng)計及分析

使用Kanatsu－shinohara的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計干擾組和NC組的小鼠睪丸內(nèi)有精子發(fā)生的曲細(xì)精管比例，結(jié)果顯示NC 組有精子發(fā)生的曲細(xì)精管的比例為97%，而NEAT1干擾組有精子發(fā)生的曲細(xì)精管比例為86%，明顯減少（P＜0.05）（圖8），小鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)精子發(fā)生過程受到影響。上述結(jié)果表明NEAT1參與維持小鼠睪丸的精子發(fā)生。

圖7 H＆E染色圖A，a為NC組，B，b為干擾組Fig.7 The images of H＆E stainingA，a are NC group，B，b are interference group

圖8 干擾組與對照組精子發(fā)生比例Fig.8 The spermatogenesis ratio comparison between two groups

3 討論

在2010年，Archa等［13］研究結(jié)果表明NEAT1在人類胚胎干細(xì)胞中表達(dá)，且能作為核心組分形成旁斑。在人類疾病研究方面，NEAT1 參與了一些重大疾病的發(fā)病過程，如卵巢癌，銀屑病等［14－15］。而NEAT1在小鼠精子發(fā)生過程中的作用對于目前尚未見報道。本試驗(yàn)則驗(yàn)證了小鼠NEAT1在睪丸和GC－1細(xì)胞系中表達(dá)并采用干擾的方法探究在小鼠中NEAT1對精子發(fā)生的影響。

試驗(yàn)結(jié)果表明，NEAT1參與調(diào)節(jié)小鼠精子發(fā)生這一重要生物學(xué)過程。在本試驗(yàn)中，干擾NEAT1后試驗(yàn)組小鼠的睪丸指數(shù)輕微增加（相對與注射NC病毒和空白對照睪丸的重量），但統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)差異并不顯著，不足以證明NEAT1對小鼠的睪丸重量有明顯的影響。2011年，Nakagawa等［16］研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1敲除小鼠可以在試驗(yàn)條件下生存且具有繁殖能力，除了無法形成旁斑結(jié)構(gòu)外，并未表現(xiàn)出明顯的表型。這與本研究得到的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。小鼠精子發(fā)生數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果表明，注射了干擾NEAT1病毒組（與NC病毒注射組相比）的精子發(fā)生比例有下調(diào)，其分別是86%和97%。該結(jié)果暗示了NEAT1有可能具有維持小鼠睪丸中精子發(fā)生的作用，NEAT1 對小鼠的生殖過程有一定的影響，但小鼠仍然具有生殖能力。

目前，在人的胚胎干細(xì)胞里的研究結(jié)果顯示，NEAT1發(fā)揮功能的機(jī)制主要是依賴RNA－蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)。研究表明，在未分化的人源胚胎干細(xì)胞中，由于缺乏NEAT1 和paraspeckles，一些對于干細(xì)胞多能性維持具有重要作用的mRNA，例如Lin28可以在轉(zhuǎn)錄之后快速出核，翻譯產(chǎn)生干細(xì)胞維持所需要的LIN28蛋白質(zhì)，在分化過程中，其通過旁斑這一亞核結(jié)構(gòu)將Lin28 mRNA 滯留在亞核區(qū)，阻礙其翻譯表達(dá)，表明NEAT1具有調(diào)控人源胚胎干細(xì)胞的命運(yùn)決定的重要作用［6］。而在小鼠的精子發(fā)生過程中，包括SSCs的自我更新與分化和后期的精原細(xì)胞分裂等過程都涉及到很多相關(guān)基因的時序性表達(dá)。比如在SSCs自我更新過程中起重要作用的Lin28（維持干細(xì)胞特性）、PLZF（SSCs中重要干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，不受GDNF 通路調(diào)控）、Bcl6b（維持SSCs自我更新周期，干擾Bcl6b會促進(jìn)小鼠SSCs的凋亡，敲除則會造成Bcl6b小鼠其曲細(xì)精管內(nèi)不同階段生殖細(xì)胞的比例出現(xiàn)異常）、Etv5（敲除Etv5會導(dǎo)致SSCs功能受損，曲細(xì)精管內(nèi)只含有支持細(xì)胞，雄性不育）等［17－19］。這些重要基因是否會被NEAT1構(gòu)成的旁斑結(jié)構(gòu)進(jìn)行表達(dá)水平調(diào)控或者通過旁斑對mRNA 的滯留效應(yīng)進(jìn)行時序調(diào)控，有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。另外，Nakagawa在2012年的研究表明，另一個lncRNA－Malat1可能調(diào)節(jié)NEAT1的表達(dá)，當(dāng)在特定細(xì)胞系中敲除Malat1 后，NEAT1表達(dá)明顯下調(diào)，表明Malat1 可以調(diào)控NEAT1 表達(dá)，影響旁斑形成［20］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示NEAT1可能具有維持小鼠精子發(fā)生的作用，從而一定程度參與小鼠的生殖過程，NEAT1 在該過程發(fā)揮功能的具體機(jī)制是什么以及Malat1 是否參與了調(diào)控NEAT1的表達(dá)進(jìn)而影響后續(xù)的旁斑形成和功能發(fā)揮則需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

NEAT1在小鼠睪丸組織、GC－1細(xì)胞系中均表達(dá)；構(gòu)建的NEAT1干擾病毒可使NEAT1表達(dá)水平下調(diào)69%，表明該慢病毒效果良好；干擾NEAT1后小鼠睪丸里的精子發(fā)生受到一定影響，表明NEAT1參與維持雄性小鼠的精子發(fā)生。

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